本发明专利技术公开了一种松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒及其使用方法，包括以下组分：超纯水d.d.?H2O?16?μL；上游引物F(5′-3′)?2?μL:?GTCAACCAGCGGAGGGAT；下游引物R(5′-3′)?2?μL:?CGCCGTTGTATTTCAGGAG；25?μL?Premix。本发明专利技术对松赤枯病检测快速，而且灵敏度高，应用于早期病害检测，为有针对性地开展松赤枯病的防治，及时解决松赤枯病问题提供了有力的技术支持。????
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病害的分子检测，涉及松赤枯病的早期快速分子检测方法，尤其涉及的是一种松赤枯病病原菌分子检测的引物及其检测试剂盒。
技术介绍
松赤枯病是松树中、幼林叶部的主要病害，广泛分布于我国，且有逐渐蔓延扩大之势。其除为害马尾松外(Pinus massoniana Lamb),还侵染其它松树，如云南松(Pinus yunnanensis)、黑松(P. thunbergii)、华山松(Pinus armandii Franch)、黄山松(P. huangshanensis)、湿地松(P. elliottii)、火炬松(P. taeda)、海岸松(P. pinaster) >油松(P. tabulaeformis)、加勒比松(P. caribaea)、岛松(P. insular is)、南亚松(P. Iatteri)、落叶松(Larix sp.)、金钱松(Pseudolarix amabilis)。各种寄主中，以马尾松、云南松、湿地松、火炬松以及黄山松受害最重，本病常与赤落叶病或落针病同时混生。松赤枯病病原菌是属半知菌类、黑盘孢目多毛孢属的枯斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiapsisfunerea Desm)。凡松林分布地区，多有此病为害。被害严重的林分似火烧,提早落叶,严重影响生长，目前在四川的达县、宜宾、绵阳、内江、南充等地林区均有松赤枯病的发现。以往检测植物真菌病害病原菌主要有形态学观察法。真菌形态鉴定方法是指通过观察真菌菌落特征，利用光学显微镜、电子显微镜等仪器观察真菌的菌丝形态、产孢结构和孢子的形态结构特征，并比对相关资料来确定真菌的分类地位。采用常规直接或培养后镜检的形态学鉴定方法来发现和确认病原菌，其操作繁琐、费时、并且需要高度的专业知识。尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难，许多时候只能鉴定到属这一级别。酶联免疫法在国外已经形成商品化生产，但是每种病原菌都需要特异的酶标记抗体，标记过程比较复杂，价格比较昂贵，且存在假阴性和假阳性问题。基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但只局限于已知的常见病原真菌，对非常见菌、突变菌或者新菌种则无能为力，且成本过高。质谱技术在微生物鉴定中具有快速准确的优点，但由于质谱鉴定必须是纯化培养的单克隆菌落，操作复杂且所需的专业技术要求较高，设备购置和维护费高昂。随着分子生物学手段的发展与应用，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来检测真核生物的方法已越来越被广泛的认可和应用。rDNA内转录间隔区(ITS)作为一种遗传标记(遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性，具有可遗传性和可识别性。生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记)，已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定。现有方法利用ITS序列对病原真菌进行鉴定前，须先经过纯菌株的分离纯化，真菌DNA的提取，PCR扩增以及亚克隆等一系列繁琐的过程。这种方法存在如下缺点(I)至少需要3-7天时间，费时费力；(2)对目前无法培养或难培养的真菌很难进一步鉴定和分析；(3)分离和培养单胞存在较高的技术难度；(4)繁琐的真菌DNA提取步骤；(5) PCR扩增片段。这些缺点极大地限制了病原菌的快速鉴定，贻误了病情。严重影响了林木的正常生长发育，对林业生产造成了巨大的经济损失。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种松赤枯病病原分子检测引物及其检测试剂盒，以实现对松赤枯病早期的快速检测。针对目前松赤枯病病原菌在生物学检测上所需周期长的问题，通过提取云南松针叶总DNA，针对松赤枯病的ITS碱基特异序列设计筛选出了一对具有高特异性的引物，用于植物组织的灵敏、快速的病原菌分子试剂盒。该试剂盒可用于松针遭受枯斑拟盘多毛孢菌侵染但在松针上未出现该病的症状(病症、病状)时快速、灵敏地检测出是否有该菌存在，从而对松赤枯病引起病害显症之前的早期检测具有十分重要的意义。该松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒，包括以下组分超纯水d. d. H2O16μ L ;上游引物 F(5 ' -3' )2μ L :GTCAACCAGCGGAGGGAT ;下游引物 R(5 ' -3' )2μ L CGCCGTTGTATTTCAGGAG ；25μ L Premix。 PCR扩增反应采用50 μ I体系，其中5 μ L松针基因组DNA原液，25 μ L Premix，引物各 2 μ L (10 μ mol/L)，ddH20 16 μ L0反应在iCycler-PCR仪上进行，程序为95°C变性4min ;95°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸7min，10°C保存。上述松赤枯病病原特异分子检测试剂盒体的使用方法Al样品处理对所采貌似健康的针叶样品，使用75%的酒精进行表面消毒处理后，保存于-70°C备用。A2提取松针总DNA:(I)取l-2g松针转移到灭菌的研钵里，加入2-3次液氮进行充分研磨，以下步骤使用的植物基因组DNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供。(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μ 165°C预热缓冲液GPl的离心管中(实验前在预热的GPl中加入巯基乙醇，使其终浓度为O. I % )，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65°C水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。(3)加入700μ1氯仿，充分混匀，12,OOOrpm(-13, 400Xg)离心5min。(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μ I缓冲液GP2，充分混匀。(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12，000rpm(-13，400Xg)离心30sec，弃掉废液。(6)向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液GD, 12，OOOrpm(-13, 400 Xg)离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入600μ I漂洗液PW，12，OOOrpm(-13，400Xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(8)重复操作步骤7。(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(-13, 400 Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，OOOrpm (-13, 400 Xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。A3PCR 反应将提取的松针基因组DNA作为模板，使用筛选出来的特异性引物进行PCR扩增。50 μ L反应体系包括:5 μ L松针基因组DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 μ L (10 μ mol/L)，ddH20 16 μ L。反应在 iCycler-PCR 仪上进行，程序为95°C变性 4min ;95°C变性 30s, 56°C复性30s，72°C延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸7min，1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：超纯水d.d.?H2O?16?μL；上游引物F(5′?3′)?2?μL:?GTCAACCAGCGGAGGGAT；下游引物R(5′?3′)?2?μL:?CGCCGTTGTATTTCAGGAG；25?μL?Premix。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘应高，潘欣，张岩，袁川，王欢，僬天敏，朱天辉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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