枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及多种蛋白酶变体以及用于获得蛋白酶变体的多种方法。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸[000? ] 序列表的引用本申请含有一个计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及相对于亲本枯草杆菌酶在一种或多种特性中展示变化的多种新蛋白酶变体，所述特性包括:洗涤性能、热稳定性、存储稳定性或催化活性。本专利技术的这些变体适合用于例如清洁剂或洗涤剂组合物中，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本专利技术变体的方法。此外，本专利技术涉及含有本专利技术变体的清洁剂和洗涤剂组合物。相关技术说明在洗涤剂工业中，酶在洗涤配制品中的应用已经超过30年。用于此类配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。越来越多商业上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体， Everlase?、Relase ?、Coronase?、Liquanase \ Ovozymex、PolarzymeR和 Kannase?丨(诺维信公司(Novozymes A/s))、Maxacal?,Properase?^Purafect?,FN2'FN3?以及FN4? (杜邦/杰能科国际公司(DuPont/Genencorinternational, Inc.))。此外，本领域描述了多种变体，如在WO 2004/041979(诺维信公司)中描述了相对于亲本枯草杆菌酶在例如洗涤性能、热稳定性、存储稳定性或催化活性方面展示变化的多种枯草杆菌酶变体。这些变体适合用于在例如清洁剂或洗涤剂组合物中使用。已描述多种有用的枯草杆菌酶变体，其中很多已提供在不同洗涤剂中的改进活性、稳定性以及溶解度。US 6，436，690 (布罗德三世(Brode III)等人)描述了在环59至66(BPN，编号)中的变化，在WO 2009/149200(丹尼斯克公司(Danisco US INC.))中描述了在位置53和55(BPN’编号)处的取代。此外，WO 2002/31133 (诺维信公司)描述了环51-56 (BPN^编号)中的插入。然而，多种因素造成进一步改进蛋白酶是有利的。洗涤条件例如就温度和PH而言不断发生变化，并且很多污物仍难以在常规洗涤条件下被完全除去。因此，尽管在蛋白酶开发方面已有深入研究，但仍然存在对新的改进蛋白酶的需要。因此，本专利技术的一个目的在于提供一种蛋白酶的与其亲本蛋白酶相比具有改进特性的多种变体。专利技术概述本专利技术涉及在与具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个(例如，若干个)位置上包含一个变化的多种蛋白酶变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且其中这些变体具有与SEQ ID N0:2至少65%—致的氨基酸序列。本专利技术还涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失，其中该变体具有与SEQ ID NO: 2至少65%—致的氨基酸序列；以及回收该变体。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。定义蛋白酶:术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括任何属于EC3.4酶组的酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号是指来自加利福尼亚州(California)，圣地哥(San Diego)，学术出版社(Academic Press)的NC-1UBMB的酶命名法1992，包括分别在欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.) 1994，223，1-5 ;欧洲生物化学杂志1995，232，1-6 ;欧洲生物化学杂志1996，237，1-5 ;欧洲生物化学杂志1997，250, 1_6 ;以及欧洲生物化学杂志1999，264，610-650中公开的补充文献I至5。 蛋白酶活性:术语“蛋白酶活性”意指蛋白质分解活性(EC3.4)。本专利技术的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型:三种主要活性类型是:其中在Pl的Arg或Lys之后存在酰胺底物裂解的胰蛋白酶样活性、其中在Pl的多个疏水氨基酸中的一个之后发生裂解的糜蛋白酶样活性、以及其中在Pl的Ala之后裂解的弹性蛋白酶样活性。出于本专利技术的目的，根据以下“材料与方法(Materials and Methods) ”所述的程序确定蛋白酶活性。本专利技术的这些枯草杆菌酶变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、以及至少100%的蛋白酶活性。等位基因变体:术语“等位基因变体”意指基因的占据相同染色体基因座的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变天然地发生，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA:术语“cDNA”意指可以通过从得自原核或真核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子反转录来制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过包括剪接的一系列步骤加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。编码序列:术语“编码序列”意指直接指明其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。控制序列:术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术变体的多核苷酸所必需的所有部件。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。为了引入特异性限制位点以便促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接，控制序列可以带有接头。表达:术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体:术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸的线性或环形DNA分子。高严谨度条件:术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹法(Southernblotting)程序，在42°C下在5X SSPE.0.3% SDS、200 μ g/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2% SDS在65°C下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。宿主细胞:术语“宿主细胞”意指对于用包含本专利技术多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失，其中该变体具有与SEQ ID NO:2至少65％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.20 EP 11194542.41.一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失，其中该变体具有与SEQ ID NO:2至少65%—致的氨基酸序列；并且回收该变体。2.如权利要求1所述的方法，其中该变体包含与具有SEQID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的两个、三个、四个或五个缺失。3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过一种方法获得该蛋白酶变体，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ IDN0:2的该成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中引入一个或多个选自下组的氨基酸的缺失，该组由Ser、Glu、Thr> Asn或Pro组成,其中该变体与SEQ ID N02具有至少65%的一致性。4.如权利要求1所述的方法，其中通过一种方法获得该蛋白酶变体，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO: 2的该成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与具有SEQID NO:2的该成熟多肽具有至少70%，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96 %、至少97 %、至少98 %、或者至少99 %、但小于100 %的序列一致性。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶是选自下组，该组由以下各项组成: (a)与具有SEQID NO:2的该成熟多肽具有至少65%的序列一致性的一种多肽； (b)由在中严谨度或高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码具有SEQ ID N0:2的该成熟多肽的一种序列、或者(iii)⑴或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽； (c)由与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码具有SEQ ID NO: 2的该成熟多肽的一种序列具有至少70%—致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及 (d)具有SEQID NO:2的该成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶与具有SEQID NO: 2的该成熟多肽具有至少65 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。8.一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与具有SEQ 10勵:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的位置进一步包含一个或多个取代，其中 (a)该变体与SEQID NO:2具有至少65%且小于100%的序列一致性，并且 (b)该变体具有蛋白酶活性。9.如权利要求8所述的变体，其中该变体在与SEQID NO: 2的位置53相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO: 2的该成熟多肽的位置54、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代，和/或 其中该变体在与SEQ ID NO: 2的位置54相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代，和/或 其中该变体在与SEQ ID NO: 2的位置55相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代，和/或 其中该变体在与SEQ ID NO: 2的位置56相对应的一个位置包含一个缺失并...

【专利技术属性】
技术研发人员：W贝森马特，A本尼，EP弗里斯，PO米奇尔森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK