一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的ITS序列及方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的ITS序列及方法。本发明专利技术公开了正品玛咖的rDNAITS全序列及利用该序列鉴别真伪玛咖的方法，包括提取总DNA，利用ITS区引物扩增，回收纯化产物，连接载体并筛选阳性克隆，测序，序列比对，玛咖真伪判别。本发明专利技术可有效检测真伪玛咖，玛咖粉末中是否掺杂其它可能伪品，如芜菁、萝卜、玉米及土豆等，可靠稳定高效地对正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖进行鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物种质资源的鉴定
，特别涉及一种新资源食品植物ー玛咖的真伪鉴别核苷酸序列和鉴别方法。
技术介绍
玛咖(Lepidium meyenii Walp.)为十字花科独存菜属一年生草本植物，原产南美洲海拔3500-4500m的安第斯山脉。玛咖具有丰富的营养价值 ，当地印加人将其作为食物。此外，玛咖还可提高生育能力，被用于解决荒寒高地人畜不育问题。随着人们对玛咖营养价值及药用价值的了解，世界范围内对玛咖的需求也逐渐增多。目前，美国、日本、西班牙、厄瓜多尔、玻利维亚、澳大利亚等已相继进行种植，但未形成規模。我国于2002年开始在云南丽江引种种植，目前已经成为全球最大的玛咖种植基地。随着科学研究的不断深入，研究者发现玛咖不仅具有提高生育能力的作用，还具有抗疲劳、缓解更年期综合症状、抗前列腺增生、抗氧化、延缓衰老及抗癌等重要功效。1992年联合国粮农组织(FAO)将玛咖作为营养补充剂向世界推荐；2001年美国食品与药品管理局(FDA)批准了玛咖保健药品进入美国。玛咖在国际市场上的需求逐渐增加，在中国市场的销量也不断提闻。巨大的经济利益使得ー些不法分子利用与玛咖相似的其他低价材料冒充玛咖。我国独荇菜属植物一共有15种，均没有膨大的根茎，而萝卜属的萝卜和芸薹属的芜菁的根茎在外形及气味上与玛咖具有较高相似性，被用来冒充玛咖干片或參入玛咖粉进行销售。更有不法分子在玛咖粉中參入一定比例的玉米粉或土豆粉以攫取非法利益。这些伪品的出现极大地伤害了消费者的权益。由于玛咖引入我国仅10余年，还未出现对玛咖进行真伪鉴别的有效的公开方法。目前从性状、气味及味道等方面对玛咖干片及玛咖粉进行鉴别难度极大；利用气相、液相及质谱等方法分析玛咖次生代谢产物的鉴别方法，一方面价格昂贵，且次生代谢产物因植株生长阶段、环境影响等不同均会一定程度上影响产品成分含量，这就可能导致出现多重标准等。所以现在急需ー种既简便又可靠且经济的方法对正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖进行鉴别。20世纪80年代以来，分子生物学技术的快速发展使人们认识到直接检测DNA序列，可以从根本上避免由表型性状或成分分析来推断物种或品种时存在的问题。ITS序列是编码核糖体RNA的核DNA序列，作为非编码区，受外界环境因素影响小，承受的选择压カ较小，为属以下水平的物种研究提供了便利，具有样品用量少，鉴定精准等优点，目前被广泛应用于药用植物的鉴别。本专利技术的优势在于，利于ITS序列通用引物对提取的DNA进行扩増，测序比对即可确认玛咖植株、玛咖干片及玛咖粉是否为真正的玛咖，是否掺杂，如掺杂，杂质为何种植物材料
技术实现思路
本专利技术主要目的是针对目前存在的伪品玛咖及掺杂玛咖，提供一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的核苷酸序列及方法，将该序列作为从DNA水平上进行玛咖真伪鉴别的DNA商品条形码。本专利技术解决其技术问题所用的技术方案是利用ITS序列通用引物ITS4和ITS5对丽江产黄、红、黑三种玛咖及秘鲁产玛咖进行ITS区序列扩增测序，结果表明丽江产黄、红、黑三种玛咖及秘鲁产玛咖的ITS序列高度保守，均为权利要求I中所述SEQ ID NO. I。利用上述ITS区序列鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的方法，包括以下步骤(I)总DNA的提取；(2) PCR扩增；(3) PCR产物电泳及染色；(4) PCR产物回收纯化；(5)连接T载体；(6)转化大肠杆菌；(7)阳性筛选;(8)测序；(9)序列比对及Blast ；真伪玛咖鉴别。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是·本专利技术提供了来源于丽江产不同颜色玛咖及秘鲁产玛咖的rDNA ITS全序列，可用于对照鉴别正品玛咖；通过从DNA水平上分析玛咖及其可能伪品的遗传特征，为区分玛咖产品，如玛咖鲜样、玛咖干样、玛咖干片、纯玛咖粉及其他可进行DNA提取的玛咖产品等提供了有效的分子标记，同时为玛咖产品的真伪鉴别及分析玛咖系统发育地位奠定一定基础。附图说明图I为提取玛咖及其伪品芜菁、萝卜、玉米和土豆总DNA后，利用ITS区通用引物扩增得到700bp左右DNA片段。图I中LYM为丽江产黄玛咖，LRM为丽江产红玛咖，LBM为丽江产黑玛咖，PM为秘鲁产玛咖，WJ为芜菁，LB为萝卜，YM为玉米，TD为土豆；图2为玛咖与芜菁rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，wj为芜菁；图3为玛咖与萝卜rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，Ib为萝卜；图4为玛咖与玉米rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，ym为玉米；图5为玛咖与土豆rDNAITS全区比对图，其中序列maca为玛咖，td为土豆；具体实施例方式实施例I本实施例测定了 ITS通用引物ITS4和ITS5对丽江产黄、红、黑玛咖，秘鲁产玛咖，丽江产芜菁，市售萝卜、玉米及土豆的rDNA ITS序列的可扩增性，并比对了这8份材料的ITS区全序列，表明玛咖ITS区具有高度保守性，与芜菁、萝卜、玉米及土豆的ITS区有巨大差异，玛咖ITS全序列可作为玛咖的商品条形码以进行正品玛咖与伪品玛咖的判别，采用的方法包括如下具体步骤(I)总DNA的提取取丽江产黄、红、黑玛咖干片，秘鲁产玛咖粉，其伪品芜菁干片，市售萝卜叶片、市售玉米叶片及市售土豆块根，利用Genestar试剂盒提取总DNA,具体方法按如下步骤操作①取各样品少许，剪碎后放入预冷的研钵中，倒入液氮速冻，迅速将其磨成粉末，利用预冷的勺子装入预冷的2ml离心管中，秘鲁玛咖粉不需研磨直接提取DNA ；②加入700 μ L试剂盒中A液，轻微震荡混匀10s，于65°C水浴30min，15min时轻轻摇匀一次；③加入700 ii L氯仿异戊醇(24:1)混合液剧烈震荡IOs后，12000rpm离心IOmin ；④200 ii L枪头剪去尖头，小心吸取上清转移入I. 5mL新离心管中；⑤加入两倍体积的预冷无水こ醇，缓慢摇匀后置于_20°C冰箱20min ；⑥用枪头挑取絮状DNA样转入装有500mL预冷的70%こ醇的I. 5mL离心管中洗涤DNA ；⑦12000rpm离心5min,弃上清,置于37°C温箱挥发剩余こ醇；⑧根据⑥中絮状DNA大小适量加入50-100 U L DNA储存液B溶解； ⑨检测DNA浓度后取少量稀释至20ng/ii L作为工作液，剰余部分_80°C保存备用；(2) PCR扩增选择ITS通用引物的ITS4和ITS5作为引物进行扩增，引物序列如下ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ITS5 :5， -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，该引物由华大基因合成，用ddH20稀释为10 PM。以总DNA为模版，按照以下体系和程序进行PCR反应；PCR 反应体系每 25 ii L 含有IOOng DNA 模版、2. 5 y L 含 Mg2+IOXBuffer, 5nmol4 XdNTP, I. 5U Taq 酶，正反引物各 IOpmol, 14. 7 u L ddH20 ；PCR 反应程序94°C预变性 5min，94°C变性 30s，52°C复性 30s，72°C延伸 lmin，35个循环，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)PCR产物电泳及染色利用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳，TAE做缓冲液进行电泳检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别正品玛咖、伪品玛咖及掺杂玛咖的ITS区序列，其特征在于：所述核苷酸序列来源于丽江产黄、红、黑玛咖及秘鲁产玛咖的rDNAITS全序列，如SEQ?ID?NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵兵，陈金金，王丽卫，赵庆生，王晓东，袁晓凡，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：