本发明专利技术公开了一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法，特点是包括10×ThermoPol反应缓冲液、浓度为100mM的MgSO4溶液、浓度为10mM的dNTP液、浓度为5M的甜菜碱溶液、浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和双蒸水，FIP引物序列如SEQIDNO.1所示，BIP引物序列如SEQIDNO.2所示，F3引物如SEQIDNO.3所示，B3引物序列如SEQIDNO.4所示，优点是具有高灵敏度、高特异性，适用于海水养殖场中大黄鱼香鱼假单胞菌病的快速检测。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及香鱼假单胞菌的检测技术，具体涉及一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
香鱼假单胞菌最初由患出血症香鱼内脏分离，近年发现在浙江、福建能引起大黄鱼内脏肉芽肿疾病。该致病菌可引起大黄鱼活动异常、内脏肉芽肿，组织坏死等症状。如2010年3月和11月宁波象山爆发了大规模的大黄鱼香鱼假单胞菌病，疫情涵盖各种规格大黄鱼，同时致病菌可通过亲鱼传递至下一代幼鱼中潜伏，大黄鱼的死亡率达60%以上，给当地养殖业带来巨大经济损失。因此预先分析、检测确定发病菌种就显得尤为重要。目前检测香鱼假单胞菌感染的方法主要包括生理生化检测、组织病理学观察、显微镜检以及PCR等生物技术诊断方法。但是这些传统检测方法不能够区分香鱼假单胞菌与假单胞菌属中的其他细菌，如恶臭假单胞菌等，缺乏灵敏度和特异性。聚合酶链式反应(PCR)具有极高的灵敏度和特异性，已被广泛应用于致病菌的诊断实践，但其需要PCR仪等诸多精密仪器的配套使用，使其无法满足现场和基层检验的需要。为有效控制大黄鱼香鱼假单胞菌病，需建立灵敏、特异、高效和简便的检测技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒，该LAMP检测试剂盒具有高灵敏度、高特异性、适用于海水养殖场中大黄鱼香鱼假单胞菌病的现场快速检测；应用该LAMP检测试剂盒的检测大黄鱼细菌感染的方法具有操作简单，对仪器要求简单，结果易于观察等优点，为香鱼假单胞菌病的早期防治提供技术支持。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括10 X ThermoPol反应缓冲液、浓度为IOOmM的MgSO4溶液、浓度为10mM的dNTP液、浓度为5M的甜菜碱溶液、浓度为8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / Β3引物溶液和双蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP 引物的核苷酸序列为GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT，所述BIP 引物的核苷酸序列为TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，所述FIP引物和所述BIP引物的浓度都为I. 6 2. 4 μ M，所述F3 / Β3引物溶液含有F3弓丨物和Β3引物，所述F3引物的核苷酸序列为TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述Β3引物的核苷酸序列为GCAGCTGCCCACTTGGT，所述F3引物和B3引物的浓度都为O. 4 O. 6 μ M。所述的LAMP检测试剂盒的100 X 25 μ L反应体系配制方法如下10 X ThermoPol反应缓冲液250 μ L、浓度为IOOmM的MgSO4溶液50 μ L、浓度为10 mM的dNTP液300 μ L、浓度为8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液100 μ L、浓度为5Μ的Betaine溶液400 μ L、引物浓度都为1.6 2.4y]\^3FIP / BIP引物溶液50 μ L、浓度都为O. 4 O. 6 μ M的F3 / Β3引物溶液50 μ L，余量用双蒸水补足。所述的ThermoPol反应缓冲液的终浓度配制方法如下200mMTris-Hcl, 100 mMKCl, 20 mM MgSO4,100 mM (NH4)2SO4,1. 0% TritonX-100，ρΗ8· 8。所述的LAMP检测试剂盒还包括有阳性对照液和阴性对照液，所述的阳性对照液含有香鱼假单胞菌阳性DNA，所述的阴性对照液为双蒸水。一种利用鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒检测大黄鱼香鱼假单胞菌病的方法，包括下述步骤 (O取被感染大黄鱼黄豆大小内脏组织一块，加入450 1的TE缓冲液，同时用医用剪刀剪碎组织，室温6000r/min洗涤离心2min，倒掉上清液，取沉淀物再加入所述TE缓冲液450 μ 1，浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ 1，质量百分浓度为20%的十二烷基硫酸钠溶液20 μ I，混匀，于37°C首次温浴30min，首次温浴结束，加入浓度为5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基铵氯化钠混合液80 μ 1，混匀，于65°C再次温浴lOmin，得到菌体温浴液； (2)在步骤(I)得到的菌体温浴液中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀，12000r/min离心5min,取上清液,所述氯仿异戍醇混合液中氯仿与异戍醇体积比为24:1 ； (3)在步骤(2)得到的上清液中加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min，取上清液再次加入等体积的所述酚氯仿异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min，如此重复混匀、离心至无白色物质为止，得到去杂上清，所述酚氯仿异戊醇混合液中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1 ； (4)在步骤(3)得到的去杂上清中加入所述去杂上清两倍体积的无水乙醇，室温放置8 12min，然后在4°C，14000r/min离心20min，弃上清，沉淀用质量百分浓度为70%的乙醇洗涤两次，然后在空气中晾晒5 20min，再加入所述TE缓冲液20 μ 1，_20°C保存，得到样品DNA模板； (5)取样品DNA模板Iμ 1，与所述鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒组成25 μ L反应体系10 X ThermPol缓冲液2. 5 μ L，dNTP溶液2. O μ L，Bst DNA聚合酶液l.OyL, MgSO4 溶液 O. 5 μ L，Betaine 溶液 4. O μ L, FIP / BIP 引物溶液 O. 5 μ L，F3 / Β3引物溶液O. 5μ L，样品DNA模板I μ 1，余量用双蒸水补足；60 65°C下反应，反应完毕，出现肉眼可见白色沉淀或反应液浑浊则该菌体为香鱼假单胞菌；或反应完毕取4. Ομ I的反应液，用经溴化乙锭(EB)染色后的I. 5%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下分析扩增结果，显示阶梯状的特异性条带为阳性，无条带为阴性。所述的TE缓冲液的pH 8. O,Tris-HCl浓度10mmol/L,乙二胺四乙酸浓度Immol/L0所述的溴化十六烷三甲基铵氯化钠混合液中溴化十六烷三甲基铵的质量百分浓度为10%, NaCl的浓度为O. 7mol/L。与现有技术相比，本专利技术的优点在于鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法，包括反应缓冲液、MgSO4溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、Betaine溶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / B3引物溶液和双蒸水，FIP引物的核苷酸序列为GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT, BIP 引物的核苷酸序列为 TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG, F3引物的核苷酸序列为AAGTGCAAGT CATCAGCT, B3引物的核苷酸序列为GCAGCTGCCCACTTGGT ;该LAMP检测试剂盒对鱼类致病菌香鱼假单胞菌具有高灵敏度、高特异性，适用于海水养殖场中大黄鱼香鱼假单胞菌病的快速检测；用该LAMP检测试剂盒检测鱼类致病菌香鱼假单胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括10×ThermoPol?反应缓冲液、浓度为100mM的MgSO4溶液、浓度为10?mM的dNTP液、浓度为5M的甜菜碱溶液、浓度为8?U?/μL?的Bst?DNA?聚合酶液、FIP?/?BIP引物溶液、F3?/?B3引物溶液和双蒸水，所述FIP?/?BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列为：GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT，?所述BIP引物的核苷酸序列为：TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，?所述FIP引物和所述BIP引物的浓度都为1.6～2.4μM，所述F3?/?B3引物溶液含有F3引物和B3引物，所述F3引物的核苷酸序列为：TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述B3引物的核苷酸序列为：GCAGCTGCCCACTTGGT，?所述F3引物和B3引物的浓度都为0.4～0.6μM。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王国良，张继挺，周涛，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：
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