本发明专利技术涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测产气肠杆菌PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：正向引物F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’；反向引物R：5’-GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG-3’。采用本发明专利技术的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明专利技术避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种用于检测的引物，具体涉及ー种用于检测产气肠杆菌PCR检测的引物，属于生物检测
技术介绍
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为革兰氏阴性菌,主要存在于人和动物的肠道内，亦可存在水、土壤及腐败物中，同时它也是ー种重要的条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位，往往会引起感染。近年来，由于第三代和第四代头孢菌·素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，使该菌的耐药菌株明显增多，有些菌株已经表现为多重耐药。多重耐药使得临床上对该菌引起的疾病的治疗趋于复杂化。多重耐药的ー个主要原因是未能在第一时间辨明病原菌，在不明病原菌的情况下，滥用药物，从而导致细菌的耐药性的出现，导致多重耐药的产生。因此，临床上迫切需要ー种快速、精准的检测手段，辨明病原，从而针对性地防治。传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。然而，通过对现有技术的文献检索发现，目前尚未有利用PCR技术检测产气肠杆菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性強。本专利技术是通过以下的技术方案实现的 一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物正向引物 F :5’ -GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’反向引物 R :5’ - GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时，具体如下操作 步骤一，提取样品DNA，PCR法扩增； PCR检测体系为20 ii L的反应体系,具体为 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2 u L, 2.5mmol/L 的 dNTPI. 6 u L, 5 U/ ii L 的 rTaq 酶0. 16 ii L, 20 PM的引物对0.8 u L, 模板 DNA1-2 uL, 最后用灭菌双蒸水补至20 uL；PCR检测反应程序为94°C预变性4min ;进入循环，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s, 30个循环；72°C延伸5min,降温至4°C，结束。步骤ニ，取10 y L PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品种是否含有产气肠杆菌；所述判断具体为1%凝胶电泳电泳检测扩增产物，若电泳结果在201bp出现单ー条带，则说明样品种含有产气肠杆菌；反之，则样品中不含产气肠杆菌。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果采用本专利技术的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本专利技术避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时，本专利技术所涉及的仪器设备、试剂等较为常用，一般基层实验室即可开展检测工作，实用性更强。本专利技术检测靶点具有単一特异性，检测结果特异，易于判定。附图说明 图I为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果 图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果 图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册' (New York Cold Spring Habor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。步骤一，设计特异性扩增产气肠杆菌的引物对 引物序列为F : 5 ’ -GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3 ’R:5’ - GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’ ； 步骤ニ，DNA模板制备 将产气肠杆菌接种于5ml营养肉汤液体培养基中，于35°C恒温摇床中振荡培养12h增菌后，取Iml菌液,放入I. 5ml无菌离心管中；12000r/min离心15min,弃尽上清液，加入500 u L灭菌双蒸水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，12000r/min离心15min，弃尽上清液，收集细菌；加入100 u L灭菌双蒸水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，置于沸水中煮15min，立即取出，在-20°C放置30min。随后35°C解冻，12000r/min离心15min，取上清液放置4°C备用或-20°C保存； 步骤三，产气肠杆菌特异性PCR检测方法建立 PCR检测体系为20 ii L的反应体系,具体为 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2 u L, 2. 5mmol/L 的 dNTPI. 6 u L, 5 U/ ii L 的 rTaq 酶0. 16 ii L, 20 PM的引物对0.8 u L, 模板 DNA1-2 uL, 最后用灭菌双蒸水补至20 uL； PCR检测反应程序为94°C预变性4min ;进入循环，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s, 30个循环；72°C延伸5min,降温至4°C,结束； 步骤四，PCR扩增结果凝胶电泳判定 所述判断具体为1%凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察电泳结果，如果出现201bp的单ー扩增条带，则说明样品种含有产气肠杆菌；反之，则样品中不含产气肠杆菌。PCR检测方法特异性评估实验 按上述DNA模板制备与PCR检测方法，对本实验室保存的产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、生癌肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、腐败希瓦氏菌进行PCR扩增反应。特异性检测结果见图I。图中泳道M为DL2000分子量标准；泳道I为模板为灭菌水蒸水的阴性对照；泳道2-10为产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTHOl株、阴沟 肠杆菌 Enterobacter cloacae 315B 株、大肠杆菌 Escherichia coli DH5 株、生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus CXl 株、弗氏朽1 樣酸杆菌 Citrobacter freundii CX2 株、粘质沙雷菌 Serratia marcescens NTH03 株、嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila NTHO71株、温和气单胞菌 Aeromonas sobria NTH072 株、腐败希瓦氏菌 Shewanella putrefaciensNTH04 株。图I中电泳结果为只有产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTHOl株在20Ibp处出现特异条带，而其他菌种未出现特异条带。PCR检测方法灵敏度评价实验 接种产气肠杆菌于3ml营养肉汤液体培养基中，置于35°C恒温摇床中振荡培养12h增菌后，用灭菌营养肉汤液体培养基10倍梯度稀释后，平板法计数得到细菌浓度为IO8Cfu/ml，取Iml菌液按实施例I提取基因组DNA，用灭菌双蒸水按10°-10_7进行1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于：正向引物F：5’?GTAACCGGTGAAACCGAAAGC?3’反向引物R：5’??GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG??3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪峰，杨国梁，王军毅，高强，张宇飞，黄雪娜，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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