The invention belongs to the technical field of detection of components of animal origin, in particular relates to a method for detecting specific primers were derived ingredients, the process is divided into specific primers designed and synthesized, DNA extraction, PCR amplification reaction system is established, and the murine component analysis evaluation results of the five steps, the specific primers according to the sequence mitochondrial cytochrome b gene in Genbank were designed and synthesized, the specific primers of the upstream primer nucleotide sequence of the F 5 \GCCTTATAATTAATTGGAGGTA 3\, sequence primer R for 5 \AGCTATATTATGTGCTTGAT 3\, mitochondrial cytochrome b gene sequences of Cyt were based on the detection of rats source components using real-time fluorescence quantitative PCR method has good specificity and reproducibility, which makes use of the primer real-time PCR assay for murine components. The utility model has the advantages of simple and convenient operation, less time consuming and high specificity, and avoids the two pollution caused by the amplification product when the product is taken out for electrophoresis in the traditional detection method, and provides a new approach for detecting the source of the mouse.
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于动物源性成分检测
,具体涉及一种特异性引物检测鼠源性成分的方法,利用特异性引物采用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)法检测鼠源性成分。
技术介绍
:PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外95℃的高温时变性成单链,在60℃左右的低温时,引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适宜的72℃反应温度,DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链,基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制;聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,能够看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加,所以,无论是化石中的古生物或历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对;老鼠肉冒充价格昂贵的牛羊肉是一些利欲熏心的商家经常采用的恶劣手段,老鼠肉直接冒充牛羊肉或掺杂在牛羊肉制品中流入老百姓的餐桌,带来了极大的社会影响,对使用者造成巨大的人身伤害,这是因为老鼠自身携带多种病菌,本身就是多种传染病病原的储存宿主和主要传染源,同时,老鼠肉所含的铅和砷等有毒有害物质的含量也远高于其他肉类,直接食用会给人们带来极大的身体危害和疫病传染风险,轻则中毒,重则死亡;目前,尚没有鼠源性成分检测的国家标准或者行业标准,普通消费者乃至食药质监部门通过肉眼难以鉴别,且传统检测方法繁琐,耗时长。本专利技术旨在通过实时荧光定量PCR核酸检测技术,开发一种特异性引物检 ...
【技术保护点】
一种特异性引物检测鼠源性成分的方法,其特征在于工艺过程分为特异性引物设计合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤:(1)、特异性引物设计合成:根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成特异性引物,特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’‑GCCTTATAATTAATTGGAGGTA‑3’,特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’‑AGCTATATTATGTGCTTGAT‑3’;(2)、DNA提取:取鼠肌肉组织1g研磨成糜状,然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作,提取DNA,经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL,纯度为1.85,用RNase/DNase‑free H2O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL,备用;(3)、反应体系建立:以步骤(2)提取的DNA为模板,用特异性引物建立10μL的PCR反应体系,取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Master mixture,剩余部分用RNase/DNase ...
【技术特征摘要】
1.一种特异性引物检测鼠源性成分的方法,其特征在于工艺过程分为特异性引物设计合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤:(1)、特异性引物设计合成:根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成特异性引物,特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’,特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’;(2)、DNA提取:取鼠肌肉组织1g研磨成糜状,然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作,提取DNA,经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL,纯度为1.85,用RNase/DNase-freeH2O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL,备用;(3)、反应体系建立:以步骤(2)提取的DNA为模板,用特异性引物建立10μL的PCR反应体系,取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Mastermixture,剩余部分用RNase/DNase-freeH2O补足,实现反应体系的建立,并设置平行试验;(4)、PCR扩增:将步骤(3)建立的反应体系置于实时荧光定量PCR仪上,设置以下条件:①、模板变性:95℃-5min;②、QPCR扩增:95℃-20s,60℃-10s,72...
【专利技术属性】
技术研发人员:王学政,季福玲,鲁艳芹,
申请(专利权)人:青岛正方元信公共卫生检测有限公司,
类型:发明
国别省市:山东;37
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