一种流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT‑LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和流感病毒RNA模板，所述的RT‑LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP。特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测证实，本发明专利技术提供的RT‑LAMP检测方法特异性检测出流感病毒，可实时监测反应并且定量检测出流感病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测流感病毒带来便利。

Reverse transcription loop mediated isothermal amplification kit for influenza virus and application thereof

The invention discloses an influenza virus by reverse transcription loop mediated isothermal amplification kit and the application, the kit includes 2 LAMP primers and RT * reaction buffer and enzyme mixture, EM fluorescence visual detection reagent, ultra pure water and the flu virus RNA template, primer LAMP RT described including outer primers and F3 B3, FIP and BIP in primer. Confirm the specificity of detection and sensitivity detection and visualization of fluorescence detection, the invention provides RT LAMP detection method for specific detection of influenza virus, can monitor the real-time response and quantitative detection of copy number of the influenza virus, rapid and accurate detection results, for the convenience of simple, rapid and reliable detection of influenza virus.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测
，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。流感病毒对外界抵抗力不强。动物流感病毒通常不感染人，人流感病毒通常不感染动物，但是猪比较例外，猪既可以感染人流感病毒，也可以感染禽流感病毒，但它们主要感染的还是猪流感病毒。少数动物流感病毒适应人后，可以引起人流感大流行。猪流感是一种急性、传染性呼吸道疾病，其特征为疾病突发，高热，精神沉郁，食欲废绝，呼吸困难，阵发性咳嗽。禽流感病毒（AIV）属甲型流感病毒，引起禽类的一种从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病。禽流感容易在鸟类间流行，过去在民间称为“鸡瘟”，国际兽疫局将其定为甲类传染病。禽流感1994年、1997年、1999年和2003年分别在澳大利亚、意大利、中国香港、荷兰等地暴发，2005年则主要在东南亚和欧洲暴发。近年来，随着集约化养殖规模的不断扩大，流感对养殖业构成了较大的威胁。此外，高致病性禽流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用，具有重大的公共卫生意义，自1918年首次报道以来，流感一直受到人们的广泛关注。目前，流感病毒的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是病毒的分离鉴定，其结果准确可靠，但常规鉴定方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长的缺点，不利于流感的快速诊断。分子生物学的方法是通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测流感病毒的特异性基因，虽然RT-PCR方法较常规方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种为快速、准确并且实时检测流感病毒的方法，提供一种快速、可视化并且可实时定量检测流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和流感病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP；其中引物的序列分别为：F3TCTGGAGGGGTGAAAATGGAB3GTGCAACTGATCCCCTCAGFIPGCCCTCTGGGCAGCTGTTTGCGAAGGACAAGGGTTGCTTABIPAAGTCGAAACCCAGGAAACGCTAATGAGTGCTGACCGTGC；所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。以上所述的流感病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的流感病毒RNA。以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgSO415-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。一种流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测流感病毒以及疑似流感病变组织是否感染流感病毒，具体检测步骤包括：（1）RT-LAMP引物的设计与合成（2）流感病毒RNA模板的提取（3）RT-LAMP反应体系建立（4）RT-LAMP检测方法。以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，2×反应缓冲液12.5μLEM1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol流感病毒RNA5μL超纯水补足25μL。以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。以上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在20-25分钟间出现扩增。本专利技术的实质性特点和显著的进步是：1）特异性强本专利技术的RT-LAMP检测方法特异性检测出流感病毒，而所检测的阴性对照病毒、阴性对照支原体和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器，普通RT-PCR法需先进行反转录（RT），然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两个反应程序，而RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程序，一个小时即可完成扩增。2）灵敏度高提取的流感病毒RNA原始浓度为6.8ng/μL，普通RT-PCR检测试剂盒的检测限约为6.8×10-2ng/μL，而使用本专利技术检测方法，检测限约为6.8×10-3ng/μL，敏感性是普通RT-PCR方法的10倍。3）迅速获得结果普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组DNA/RNA提取到获取试验结果，需要5-6小时左右。本专利技术提供的RT-LAMP检测方法反应在20分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便：依据反应管浊度值的变化情况即可判读结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析或者反应结束后加入荧光染料来判读结果，从病毒基因组DNA/RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。4）不造成污染目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本专利技术的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖，能有效避免气溶胶污染实验环境。此外，本专利技术的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。5）可实时定量本专利技术利用Tubidimeterreal-timeLA-320C浊度仪来实时分析RT-LAMP反应过程，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的流感病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。附图说明图1是本专利技术RT-LAMP方法特异性检测结果；其中试验病毒有猪流感病毒（SIV）和禽流感病毒（AIV）；对照毒株有：猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、圆环病毒2型(PCV2)、巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪支原体（MH），灭菌超纯水作为阴性对照（Negative）。结果显示，只有流感病毒反应管出现浊度的上升曲线，6个对照反应管和阴性对照反应管均无扩增。图2是使用本专利技术RT-LAMP方法进行的流感病毒敏感性检测结果，图3是普通RT-PCR检测方法进行的流感病毒敏感性检测结果；其中1：6.8ng/μL；2：6.8×10-1ng/μL；3：6.8×10-2ng/μL；4：6.8×10-3ng/μL；5：6.8×10-4ng/μL；6：6.8×10-5ng/μL；7：6.8×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT‑LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和流感病毒RNA模板，所述的RT‑LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP；其中引物的序列分别为：F3 TCTGGAGGGGTGAAAATGGAB3 GTGCAACTGATCCCCTCAGFIP GCCCTCTGGGCAGCTGTTTGCGAAGGACAAGGGTTGCTTABIP AAGTCGAAACCCAGGAAACGCTAATGAGTGCTGACCGTGC所述的2×反应缓冲液包括Tris‑HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和流感病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP；其中引物的序列分别为：F3TCTGGAGGGGTGAAAATGGAB3GTGCAACTGATCCCCTCAGFIPGCCCTCTGGGCAGCTGTTTGCGAAGGACAAGGGTTGCTTABIPAAGTCGAAACCCAGGAAACGCTAATGAGTGCTGACCGTGC所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。2.根据权利要求1所述的流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的流感病毒RNA模板取自病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒。3.根据权利要求1所述的流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。4.根据权利要求1所述的流感病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭昊，李军，冯世文，潘艳，陈泽祥，胡帅，杨威，钟舒红，马春霞，陶立，谢永平，许力干，韦志锋，兰美益，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45