运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法，其中试剂盒借助生物信息平台进行大规模基因组分析，根据运动发酵单胞菌的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶基因

Sports ferment single cell ring mediated constant temperature gene amplification rapid detection kit and detection method

The invention discloses a Zymomonas mobilis loop mediated isothermal rapid detection kit and detection method of gene amplification, the kit with biological information platform for large-scale genome analysis, according to the 3 dehydrogenase gene of Zymomonas mobilis Glyceraldehyde

【技术实现步骤摘要】
运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种利用环介导恒温基因扩增（loop-mediatedisothermalamplificationofDNA，LAMP）技术进行菌样快速检测的试剂盒，具体涉及一种运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
近几年随着人口和工业的快速连续增长大大加速了能源消耗，导致全球面临潜在的能源危机。同时伴随着燃料价格的不断提高和化石燃料的急剧缩减，这就促使了全球寻找可替代的可再生能源。其中生物燃料被认为是传统化石燃料最主要的替代品。生物乙醇是一种可再生能源，它的消费过程不仅解决了传统燃料的环境污染问题，解决了农林产品的下脚料给环境带来的巨大污染，而且还大大降低了获得矿物质能源的成本。生物发酵法生产乙醇在一些国家和地区被广泛使用，巴西每年以甘蔗作为原料，生产1100万吨燃料乙醇；美国则每年大约生产550万吨以上的燃料乙醇；目前我国生物乙醇年产量为300多万吨，仅次于巴西、美国列世界第三。运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis,Zm）为兼性厌氧的革兰氏阴性细菌，主要通过Entner-Doudoroff（ED）途径代谢葡萄糖、果糖和蔗糖等，其独特的代谢途径和高效的乙醇发酵特性使得该菌株在食品、医药、化工和生物能源等领域存在巨大的应用潜力，因而对运动发酵单胞菌的研究也在不断深入。运动发酵单胞菌有快速高产的将葡萄糖转化为乙醇、可以耐受高温、乙醇浓度和糖浓度、非耦联的生长和发酵即醇生产过程与生长不相关等特点，使其在产醇方面的应用尤其得到重视。目前针对运动发酵单胞菌有多种检测方法。传统的增菌培养方法一般需要10天以上，周期较长，并且需要使用实验动物，成本较高；免疫学检测（Immunoassay，IA）是一种根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知抗体或利用已知的抗体检测未知抗原的技术，主要包括酶联免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向间接血凝法（RPHA）和反向乳胶凝集实验（RPLA）等，此类方法周期短，一次可检测大量样本，并且不需实验动物，但其缺点是必须有高亲和性的抗体；实时荧光定量PCR方法能够用于病原菌的检测，但对仪器设备和人员的专业技术水平要求较高，并且操作复杂，耗时较长，限制了该技术的推广。DNA环介导恒温核酸扩增技术（LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增方法，此技术克服了以往基因扩增方法的不足，能够在恒温条件下进行核酸的扩增，具有简单、快速、成本低和特异性强等优点，适于现场检测，有较好的应用性。目前，还没有专门针对运动发酵单胞菌的环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的相关记载。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种快速灵敏准确的运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案：运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPolBuffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，内引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，内引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；（3）8U/μLBstDNA聚合酶；（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBRGreenI荧光染料；上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPolBuffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物10.5μL、10μmol/L外引物20.5μL、40μmol/L内引物11μL和40μmol/L内引物21μL。本专利技术所述的运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：步骤（1），提取待检样品的基因组DNA；步骤（2），环介导恒温扩增反应，取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL8U/μLBstDNA聚合酶，将配置好的反应体系在65℃扩增反应50-70min后取出待检；步骤（3），分析判断反应结果，在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。本专利技术根据运动发酵单胞菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gap设计了四条特异性引物，该基因序列为运动发酵单胞菌所共有，以保证检测不同来源的运动发酵单胞菌的可靠性。本专利技术采用LAMP技术，针对运动发酵单胞菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本专利技术的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其它任何分析设备，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低和操作简便等优点，可用于运动发酵单胞菌的快速检测。附图说明图1是不同菌株的阳性扩增结果对比图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术中试剂盒及检测方法的建立和应用作进一步说明，但并不以任何形式限制本专利技术的内容。实施例1运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的建立步骤（1），引物的设计、合成试剂盒的组装本实施例确定用于检测的引物序列如下：外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，内引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，内引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；在此基础上设计用于运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPolBuffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）组成；（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；（3）8U/μLBstDNA聚合酶；（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBRGreenI荧光染料；上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPolBuffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引本文档来自技高网...

【技术保护点】
运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，内引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT‑CTTGTCATCTGCGGTCAGG，内引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC‑CGGGTATCTTCACCAACACC；（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L内引物1 1μL和40μmol/L内引物2 1μL。...

【技术特征摘要】
1.运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPolBuffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，内引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，内引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；（3）8U/μLBstDNA聚合酶；（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBRGreenI荧光染料；上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐雅梦，姜晓冰，姜晓杰，于涛，张艺鸽，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41