一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种能够快速、准确、灵敏的检测大型畜牧动物是否感染口蹄疫病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。所述环介导等温扩增引物组包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2，所述内引物1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述内引物2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述外引物1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述外引物2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述环引物1的序列如SEQ ID NO：5所示，所述环引物2的序列如SEQ ID NO：6所示。所述试剂盒包括所述环介导等温扩增引物组和反应液，能够快速、准确、灵敏的检测大型畜牧动物是否感染口蹄疫病毒。

Loop mediated isothermal amplification primer set and kit for detecting foot and mouth disease

The invention provides a loop mediated isothermal amplification primer set and a kit for detecting whether a large livestock animal is infected with foot-and-mouth disease virus with a fast, accurate and sensitive method. The loop mediated isothermal amplification primers, 1 primers within the group include 2 inner primers and outer primers, 1 outer primers, 2 primers and 1 primers of 2 ring ring, such as the SEQ ID NO:1 shown in sequence 1 primers, such as SEQ ID NO:2 shows the sequence of primers in 2 such as SEQ, ID NO:3 shows the sequence of 1 outer primers, such as SEQ ID NO:4 shown in the sequence of 2 outer primers, the SEQ ID NO:5 ring as shown in sequence 1 primers, 2 primer sequence of the ring as shown in SEQ ID NO:6. The kit comprises a ring mediated isothermal amplification primer set and a reaction liquid, and can rapidly, accurately and sensitively detect whether a large livestock animal is infected with foot-and-mouth disease virus.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组及试剂盒
本专利技术属于领域属于口蹄疫病毒检测
，具体涉及一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
技术介绍
口蹄疫(Foodandmouthdiseasevirus，FMD)是由口蹄疫病毒(FoodAndMouthDiseaseVirus，FMDV)引起的一种急性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，如牛、猪、羊等；其特征是发热、皮肤或粘膜发生水溃疡，尤其是在口腔和蹄叉部位。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，约有8500个核苷酸组成。病毒基因组有一个开放性阅读框(ORF)、一个5’端非编码区(NCR)和3’端非编码区(NCR)组成，ORF编码由4中结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)、RNA聚合酶(3D)、蛋白酶(L、2A、3C)以及其他非结构蛋白(如3A等)组成。口蹄疫病毒包括7个血清型和60余个亚型，7个血清型为：O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型，并且各血清之间无交叉免疫反应。口蹄疫在亚洲主要流行有A型、O型、C型、AsiaI型4个血清型，截止目前，我国仅见O型、亚洲I型、A型三个血清型的口蹄疫。但是非洲型和C型出现在我国周边国家中，对我国威胁较大。因此建立快速、准确、灵敏、特异的现场检测方法对口蹄疫的预防与控制具有重大意义。目前检测口蹄疫的方法有间接夹心酶联免疫吸附试验、反向间接血凝试验、中和试验、液相阻断酶联免疫吸附试验、非结构蛋白ELISA检测、正向间接血凝试验等。但这些方法都依赖检测相应的抗体，属于血清学检测方法。另一种方法是病源生物学方法，并且这种方法耗费时间长，并且对试剂样本有一定依赖性。由于口蹄疫病毒高度变异性和交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。。专利申请号为200810034124、201210221684和201310067020的专利技术专利分别提供了O型、C型和7种血清型分型的环介导等温扩增快速检测试剂盒，相对于PCR或血清学检测方法，灵敏度高，检测快。但是，专利技术专利200810034124和201210221684中提供的试剂盒只能检测到样本是否为O型或C型口蹄疫病毒，对于其他血清型口蹄疫病毒则呈现出阴性结果。而专利技术专利201310067020提供了7种血清型分型的试剂盒，但是在7个反应管中，每个管中单独检测一种类型血清型。其制造成本和使用成本相对较大，严重限制了其在现场实际应用价值。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种能够快速、准确、灵敏的检测大型畜牧动物是否感染口蹄疫病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。本专利技术所采用的技术方案为：一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组，包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2，所述内引物1的序列如SEQIDNO：1所示，所述内引物2的序列如SEQIDNO：2所示，所述外引物1的序列如SEQIDNO：3所示，所述外引物2的序列如SEQIDNO：4所示，所述环引物1的序列如SEQIDNO：5所示，所述环引物2的序列如SEQIDNO：6所示。SEQIDNO：1的序列为：TTCCGCAAATAGCAGCAG；SEQIDNO：2的序列为：CTGGAGCTATGCTTTATGC；SEQIDNO：3的序列为：TGGTGTGAGTCTCCACGTCAACGAACACAATCGACGTACTGT；SEQIDNO：4的序列为：TCTCCTACGGCGACGAGTTCGGAAGCAAGGGATGATACC；SEQIDNO：5的序列为：TCACGGTGCTTGAGCTAAGAC；SEQIDNO：6的序列为：GGTTGCAAGTGCGTACGTGGAG；本专利技术还提供了一种含有所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括反应浓缩液和逆转录酶；所述反应浓缩液包括DNA聚合酶，酶缓冲液，dNTP，MgSO4，甘氨酸三甲胺内盐和荧光染料。所述试剂盒能够快速、准确、灵敏的检测大型畜牧动物是否感染口蹄疫病毒。使用所述试剂盒检测口蹄疫病毒的方法，包括以下步骤：(1)病毒RNA提取：采集疑似感染口蹄疫病毒的牲畜的血清，提取样本RNA并逆转录为cDNA作为样品；(2)引物处理：将内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2等体积混匀，得到引物试剂；在混合前，内引物1和内引物2的浓度为40nM，外引物1和外引物2的浓度为5nM，环引物1和环引物2的浓度为20nM；(3)环介导等温扩增反应：将样品、引物试剂和反应液混合均匀后，放入定量PCR仪或等温扩增荧光检测系统，在65℃下，进行环介导等温扩增反应：共进行60个循环，每个循环的时间为30秒；(4)溶解曲线分析：在环介导等温扩增反应过程中，对cDNA的浓度进行分析，得到扩增曲线和溶解曲线；(5)结果判断：根据所获得扩增曲线和溶解曲线判定，若扩增曲线为明显的S型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显S型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显S型曲线，但溶解曲线峰型不单一，则判定为非特异性扩增。需要说明的是，核酸的等温扩增法属于核酸体外扩增诸多方法中的一类，在核酸扩增过程中温度恒定不变，即不需要环境温度的反复变化即可完成DNA的复制和扩增，其技术的核心在于其独特的引物结构和扩增方式以及具有特殊活性的DNA聚合酶的使用，本申请中使用的是等温扩增荧光法。等温扩增荧光法(IsothermalAmplificationFluorescentIdentificationMethod)是核酸等温扩增和荧光技术的结合，其反应过程在恒温条件下进行，通过添加有特殊链置换活性的DNA聚合酶和针对目标基因特异性片段设计的特异性引物组使核酸扩增得以在恒温条件下来完成，同时在体系中加入荧光基团即荧光标记物，该荧光标记物能特异性结合到DNA双链氢键的小沟部分，且结合到DNA双链之后可被激发并发出特殊波长的荧光，该荧光标记物在单独存在的情况下不会被激发且只与DNA双链结合，故体系中的荧光强度即代表了体系中DNA双链的浓度，最后通过荧光信号累积实时监控整个核酸扩增过程，实现核酸扩增的实时监测，核酸复制扩增反应结束后可对产物做退火溶解曲线分析，溶解曲线可进一步坚定该核酸扩增产物是否是特异性扩增。结合技术的应用，实现了在确保实验结果准确性，该方法是一种高特异性的快速扩增法，非常适合口蹄疫病毒的现场快速检测。因体系中加入了能特异性与DNA双链集合的荧光物质，故随着扩增的不断进行和产物的累积，能实时监测整个扩增反应的全过程并做到定性和简单的定量分析。为进一步增加检测的准确性，方便实验人员对照使用，优选的技术方案是，所述试剂盒还包括对照物，所述对照物包括阳性对照物和阴性对照物。在检测时，同时使用阳性对照物和阴性对照物作为样本进行检测，当阳性对照物的检测结果是阳性结果，且阴性对照物的检测结果是阴性结果时，则本次测试有效，否则本次测试无效。根据本专利技术的一个实施例，所述阳性对照物为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQIDNO：7所示，所述阴性对照物为不含目的基因的反应液或双蒸水。SEQIDNO：7的序列为：AAACGCATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2，所述内引物1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述内引物2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述外引物1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述外引物2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述环引物1的序列如SEQ ID NO：5所示，所述环引物2的序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2，所述内引物1的序列如SEQIDNO：1所示，所述内引物2的序列如SEQIDNO：2所示，所述外引物1的序列如SEQIDNO：3所示，所述外引物2的序列如SEQIDNO：4所示，所述环引物1的序列如SEQIDNO：5所示，所述环引物2的序列如SEQIDNO：6所示。2.一种含有权利要求1所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，还包括反应液，所述反应液包括反应浓缩液和逆转录酶；所述反应浓缩液包括DNA聚合酶，酶缓冲液，dNTP，MgSO4，甘氨酸三甲胺内盐和荧光染料。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张薇，王耕，王振超，陈安东，
申请(专利权)人：张薇，
类型：发明
国别省市：云南,53