本发明专利技术公开了一种花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，可用于花生青枯病菌的特异性检测。通过设计花生青枯病菌的LAMP检测引物，包括外侧引物F3：5’-TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’，B3：5’-AAACACCGATCTCTCGATGC-3’；内侧引物FIP：5’-CCAGTTCACGGCAAGATCGCTTTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’，BIP：5’-ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’。经恒温扩增，采用SYBRgreenⅠ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明专利技术的LAMP引物及检测方法可用于生产实践中花生青枯病菌感染的植株或者发病潜伏期时花生青枯病菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治花生青枯病菌引起的病害提供可靠的技术和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
，具体涉及一种花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，可用于花生青枯病菌的高灵敏度、快速的特异性分子检测，还可用于花生青枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
技术介绍
花生青枯病是由WWoflia SoJaflacearw引起的一种细菌性维管束病害。该病害于1905年在印度尼西亚首次报道，随后在20多个国家和地区相继发生或出现报道。目前，主要以中国、印度尼西亚和越南危害较重。我国关于花生青枯病的报道始见于30年代后期，现在主要分布于中部和南方地区，每年全国实际病地面积在40万hm2以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病发病率一般在10% - 30%左右，减产20%以上；重病区发病率可在50%以上，甚至导致完全绝收。近年来有报道显示，花生青枯病表现出向北蔓延的趋势，给花生生产带来更大威胁。除引起减产外，青枯病的发生还会降低花生品质，并增加黄曲霉毒素的污染。同时，花生青枯病是一种土传病害，可经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，且其侵染能力强，在较短的时间内可造成植株枯萎死亡。随着设施农业的高度集约化生产，复种指数高，品种单一，导致该类病害的发生越来越严重。因此，开展花生青枯病菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。目前，关于花生青枯菌的检测方法包括传统分离培养法、血清学和分子生物学等方法。青枯病菌的传统检测方法是采用选择性培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断，该方法易受外界因素的影响且灵敏度较低。而应用血清学方法时血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，造成检测结果的假阳性，难以满足对花生青枯病诊断的实际需要。因此，建立一套快速、灵敏、准确的花生青枯病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的新途径，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了 PCR检测方法的推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,简称 LAMP)是 2000 年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物,利用一种链式置换活性的DNA聚合酶DNA polymerase),在恒温条件下(60 - 65°C )保温30 - 90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增IO9 - 101°倍，其扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，将LAMP方法应用于花生青枯病菌的检测国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，本方法易于操作、特异性强、灵敏度高，可得到准确可靠的实验结果。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，其具体步骤如下: 1、LAMP引物的设计:根据花生青枯病菌的16S-23S rDNA ITS序列采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物,包括一对外引物和一对内引物，引物序列如下:外侧引物 F3:5’ -TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’ (SEQ ID N0:1)；B3:5’ -AAACACCGATCTCTCGATGC-3’ (SEQ ID NO:2)； 内侧引物 FIP:5’ -CCAGITCACGGCAAGATCGCITTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’ (SEQ IDNO:3)；BIP:5’ -ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’ (SEQ ID NO:4)。2.花生青枯病菌快速检测体系的建立: 1)采用NaOH快速裂解法提取花生青枯病菌的DNA，具体步骤如下: a.将花生病茎用清水洗净、晾干； b.按Img病茎加入10(0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，12000rpm 离心 5min ； c.取上清液20u I与等体积的0.1 mo I/L的Tris-HCl (pH8.0)混合，所得溶液稀释10倍作为LAMP反应的DNA模板。2)利用所设计的LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25 U 1，包括5 ii M外侧引物F3和B3各0.25iU，40iiM内侧引物FIP和BIP各0.25μl，反应混合液18.0u 1,8ubst DNA聚合酶1 μl，DNA模板25ng，用灭菌超纯水补足至25 U 1 ; LAMP反应条件为65 °C温育 60 min,82°C保温 IOmin ； 所述的反应混合液中各组分的浓度为40mM Tris-HCl, 20mM (NH4)2S04, 20mM KC1，16 mMMgSO4,0.2% Triton X_100，1.6M Betaine, 2.8 mM dNTPs。3、结果测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green I 1 U 1，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2iU PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。本专利技术可用于花生青枯病潜伏期或者发病期时的病害检测。建立针对花生青枯病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于花生青枯病菌引起病害显症之前的早期监测，及确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。本专利技术有益效果: 本专利技术方法适用于花生青枯病菌感染的植株或发病潜伏期时花生青枯病菌的快速可靠的检测、鉴定，对于防治农业生产中花生青枯病菌引起的病害具有重要的实用价值。本专利技术与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果: 1、特异性强:本专利技术所设计的LAMP检测引物是针对花生青枯病菌16S-23S rDNA ITS序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性强。2、灵敏度高:本专利技术所设计出的LAMP引物，对花生青枯病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg。3、实用性好:本专利技术所设计出的LAMP引物，可用于花生青枯病菌感染的植株或者发病潜伏期时的高灵敏度快速检测，对花生青枯病的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。4、操作简便快速:应用本专利技术检测方法，对花生青枯病菌感染的植株或者发病潜伏期的植株检测可在数小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。【附图说明】图1为本专利技术对花生青枯病菌的特异性检测结果图，图A为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种花生青枯病菌的LAMP检测引物，其特征在于：根据花生青枯病菌的16S?23S?rDNA?ITS序列设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，外侧引物F3序列为SEQ?ID?NO:1；B3序列为SEQ?ID?NO:2；内侧引物FIP序列为SEQ?ID?NO:3；BIP序列为SEQ?ID?NO:4。
【技术特征摘要】
1.一种花生青枯病菌的LAMP检测引物，其特征在于:根据花生青枯病菌的16S-23SrDNA ITS序列设计一种LAMP检测引物，包括一对外弓丨物和一对内引物,外侧引物F3序列为SEQ ID N0:1 ;B3 序列为 SEQ ID NO: 2 ;内侧引物 FIP 序列为 SEQ ID NO: 3 ;BIP 序列为 SEQID N0:4。2.权利要求1所述的花生青枯病菌的LAMP检测引物的应用方法，其特征在于:利用所设计的LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25 yl，包括5 y M外侧引物F3和B3各.0.25ii l，40iiM内侧引物FIP和BIP各0.25 y I，反应混合液18.0 y l,mBst DNA聚合酶.111...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢世勇，李本金，陈庆河，游泳，丁雪玲，刘裴清，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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