本发明专利技术公开了用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，特点是包括三对LAMP的引物TolC-F3、TolC-B3、TolC-FIP、TolC-BIP、TolC-LF、TolC-LB和一条探针TolC--HP步骤，其中Van-FIP为5’端生物素标记引物，探针TolC-HP为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针，具体序列如序列表中SEQNO1-NO7所示，优点是具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于创伤弧菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
【技术实现步骤摘要】
用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列
本专利技术涉及一种创伤弧菌的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列。
技术介绍
创伤弧菌{Vibrio vulnificus)为革兰氏阴性嗜盐弧菌，普遍存在于河口和海水环境中，鱼类及贝母类等为主要易感水生动物。同时，该菌是人兽共患病的重要病原，人通常是因为生食受污染的海产品，或者伤口接触受污染的海水或海洋动物而感染该细菌。细菌感染患者主要出现原发性败血症、创伤感染、急性胃肠炎和蜂窝织炎等临床症状，其中引起的败血症性休克的死亡率可高达50%。在我国，创伤弧菌感染多发生于沿海地区，被列为食品污染源中八大高危微生物之一，对于该病的诊断和鉴别具有重要的公共卫生学意义。创伤弧菌引起的最初症状并无明显特异性，在感染早期完成诊断和鉴定显得尤为重要。因此，建立一种快速、准确、操作简便而又适用于临床检测的致病菌检测方法具有极大的应用价值。传统创伤弧菌鉴定主要通过病原分离与生化鉴定完成，但其存在细菌培养繁琐，检测周期长，不易鉴别相近物种或亚型等缺点。随着分子生物学检测技术的发展，以溶血素基因、DNA回旋酶B亚基(gyrB)、toxR基因、RNA聚合酶σ亚基因子S (rpoS)等基因为靶标建立的常规PCR或real-time PCR技术已成功应用于创伤弧菌的实验室诊断，具有灵敏度高，检测时间短等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是由日本学者Notomi专利技术的一种新式恒温核酸扩增技术，其反应依赖于具有链置换活性的ifeiDNA聚合酶，通过4个特异引物，在恒温条件下(65°C左右)高效(30 mirTl h)扩增目标DNA，相比于PCR相关检测技术，具有检测时间更短，仪器依赖性小等优点，具有应用于现场疫源地检测的巨大潜力。LAMP的反应产物可通过琼脂糖凝胶的方法进行判定，但该方法存在操作过程易污染，易出现假阳性的缺点。LAMP检测与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick, LFD)技术联用(LAMP-LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，不仅可避免非特异性扩增引起的假阳性，同时还能够避免因琼脂糖凝胶电泳等检测手段引起的体系污染问题，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测不需特殊设备以及EB等有毒试剂，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液即可，操作简便、安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察，LFD试纸条上有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色、检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。目前，该技术已成功运用于桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV)、对奸白斑症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosisvirus, IMNV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鳗利斯顿氏菌iListonella anguiIlarum'),观镇内对于该技术的应用于创伤弧菌的诊断和检测中未见相关报道，即使国外文献(Thanai Surasilp a, Siwaporn Longyantа,Sombat Rukpratanporn b, Pattarin Sridulyakul a,Rapid and sensitive detectionof Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification combined withlateral flow dipstick targeted to rpoS gene, Molecular and Cellular Probes ,2011,25:158-163)中有相关报道，但其检测灵敏度和检测速度都远不及本专利技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为: 一种用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolC (GenBank登录号:DQ296643)的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下:TolC-F3:5’ -TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，TolC-B3:5’ -CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，TolC-FIP:5’ - TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3’，TolC-BIP:5’ -GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，TolC-LF:5’ -GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，ToIC-LB: 5， -AACCTATCGAATGCACGCT-3，,探针 TolC-HP:5’ -GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’， 其中，TolC-FIP的5’端为生物素标记；探针TolC-HP的5’端为异硫氰酸荧光素标记。具体检测方法步骤如下: 1)根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolCXGenBank登录号:DQ296643)的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，序列如上所述: 2)配置LAMP反应体系:反应体系各成分的终浓度分别为:外引物TolC-F3和TolC_B3各 0.2 Mmol/L,内引物 TolC-FIP 和 TolC-BIP 各 1.6 Mmol/L，环引物 TolC-LF 和 TolC-LB各 0.4 Mmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, Tris-HCl (pH 8.8) 20mmol/L, KCl IOmmoI/L，MgSO4б.5mmol/L, (MM)2SO4 IOmmoI/L，Triton X-1OO 0.1%, 8U Bst DNA 聚合酶大片段(NewEngland Biolabs)和2 PL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25 μ? ； 3)LAMP反应体系扩增:将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63°C，扩增反应时间为35 min ； 4)探针杂交和LFD检测:扩增后将20pmol的探针TolC-HP加入反应体系中，63°C温育5 min，进行杂交，取5 PL杂交液加入100 μ?缓冲液中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的缓冲液中显色，判断横向流动试纸条检测LAMP扩增的结果。与现有技术相比，本专利技术的优点在于: 1、检测灵敏度高，本方法的检测灵敏度为3.7X IO2 cfumL—1，相对于
技术介绍
中所涉及的国外文献(Rapid an本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于创伤弧菌的LAMP?LFD检测的引物和探针序列，其特征在于根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolC（GenBank登录号：DQ296643）的编码序列设计LAMP??LFD的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：TolC?F3：5’?TCTTGAAGCCACTTATCGC?3’，TolC?B3：5’?CAGCATCAACATCCAGTACA?3’，TolC?FIP：5’?–TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT?3’，TolC?BIP：5’?GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT?3’，TolC?LF：5’?GGTTGCTTCTAATGCTGAACG?3’，TolC?LB:?5’?AACCTATCGAATGCACGCT?3’，探针TolC?HP：5’?GGTACTCGTACTATTGTGGAT?3’，其中，TolC?FIP的5’端为生物素标记；探针TolC?HP?的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
【技术特征摘要】
1.一种用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其特征在于根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolC (GenBank登录号:DQ296643)的编码序列设计LAMP- LFD的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下:TolC-F3:5’ -TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，TolC-B3:5’ -CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，TolC-FIP:5’ - TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATG...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈炯，周前进，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：
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