本发明专利技术提供了一种快速检测海洋创伤弧菌的检测试剂盒，本发明专利技术对引物进行了优选，使用优选后的引物及检测试剂可以达到准确、灵敏、快速检测创伤弧菌的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用环介导扩增（LAMP)技术对创伤弧菌进行快速检测的试剂盒， 属于医学临床检验
技术介绍
创伤弧菌（Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，是一种广泛 分布于亚热带浅海水域及海产品如贝类、虾、蟹等，由Farmer等于1979年首先报道。创伤弧 菌的感染造成临床上的病症有两种，即原发性败血症和严重的窗口感染，也可导致坏死性 胃肠炎、脑膜炎、肺炎、眼角膜炎等疾病。败血症多与生食含菌的牡蛎等贝类海产品有关，尤 其好发于肝硬化、血色素沉着症、地中海贫血等体内荷铁量过多的人群中，病死率超过50%。 皮肤创口受海水中的创伤弧菌感染，常导致严重的组织坏死。创伤弧菌的确切致病机制至 今尚未完全明了。目前认为该菌可以产生众多的致病相关物质，如胞外溶细胞素、金属蛋白 酶(弹性蛋白分解酶)、荚膜多糖（CPS)、磷脂酶、内毒素以及儿茶酚亲铁物质等。创伤弧菌是 美国海产品消费引起死亡的首要原因，美国州际贝类卫生委员会（ISSC)规定，收获后经处 理的牡蛎中创伤弧菌限量不超过30CFU/g估计日本每年创伤弧菌败血症病例数约为425 例。我国台湾地区1996-2000年每年创伤弧菌感染人数13~26例，大陆沿海地区也时有创 伤弧菌散发感染的报告。 创伤弧菌的高致病性已引起世界范围的关注，目前已列为水产养殖业和进出口水 产重点检验检疫的致病菌之一。该菌的检测方法曾经以分离培养和理化鉴定为主，整个过 程耗时费力，灵敏度底，不能满足快速检测的需要。在特异性方面，由于创伤弧菌的表型不 稳定，非典型菌株较为常见，采用普通的理化鉴定得到的检测结果可靠性差；酶联免疫吸附 试验虽然具有一定的特异性和敏感性，但仍然需要结合细菌分离才可进行，仍然不是一种 快速检测方法。RT-PCR方法检测创伤弧菌是一种新的检测技术，其简便、快速、准确，灵敏特 异性好等特点，但需要昂贵的PCR仪，以及不同的操作温度。环介导等温扩增（LAMP)是继 PCR技术发展起来的基于检测遗传物质DNA的一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识 别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可 高效、快速、高特异地扩增靶序列；其特点是无需特殊的、昂贵的检测仪器，只需简单的恒 温设备或者是加热块，即可完成PCR扩增，可以满足现场检测的需要。环介导等温扩增方 法近几年在病原体检测方面运用较多。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种快速的检测海洋创伤弧菌试剂盒。本 专利技术提供了一组特异性强、灵敏度高的用于检测创伤弧菌的LAMP引物，可以快速准确的检 测创伤弧菌。 本专利技术的技术方案如下： 一种快速检测海洋创伤弧菌试剂盒，包括下列组分： (1) 10*反应缓冲液 2.5yL (2) dNTP Mixture lOmM each 3. 5 y L (3) 甜菜碱 5mol/L 4 y L (4) MgS04 1 50mmol/L 1 y L (5) Bst 酶 8000U/mL 1 y L (6) ?丐黄绿素 4mmol/L 1 y L (7) 去离子水 4yL (8) 引物 FIP 引物 20 ymol/L 2 y L BIP 引物 20 ymol/L 2 y L F3 引物 8 ymol/L 1 y L B3 引物 8 ymol/L 1 y L (9) 阳性对照 DNA 10 y mol/L ; 所述10*反应缓冲液组成如下 Tris-HCl PH 8. 8， 200mM KC1 lOOmM (NH4) 2S04 lOOmM MgS04 20mM Triton X-100 1% ； 所述阳性对照DNA，是用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp)重 组入质粒所得。 本专利技术的引物序列如下： FIP引物： 5' CCTCTTGACCTCCTACTCTGCTCTTACATGACCCTGCCGATTTC' 3 (SEQ ID N0:1); BIP引物： 5' TGACTCCCACGCATTTTGCACTGCAGTGTATCTGTTGCCGC ' 3 (SEQ ID N0:2); F3引物： 5' TCTATTATTCTCCAAGCTC' 3 (SEQ ID N0:3); B3引物： 5' CCCTACGTATTCCCTTGTCCC' 3 (SEQ ID N0:4)。 具体操作步骤如下： 1、 取各试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存； 2、 预混溶液的配制(请在冰上进行） (1)反应按照下表比例在试管中进行配制 表1 LAMP法检测操作流程(2) 轻轻弹击试管，使其充分混合后放入简易微量离心机中离心数秒，以此作为预混溶 液； (3) 样本反应加入2uL样本DNA ;阴性对照反应使用去离子水2uL ;阳性对照反应使用 阳性对照DNA 2uL，使总量达到25ul ; (4) 扩增反应 1) 将已配制好、分装完毕的反应试管置于恒温金属浴中，在63°C条件下反应50分钟； 2) 80°C条件下恒温5分钟或95°C条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。 本专利技术提供一组检测创伤弧菌的引物，该组引物是依据NCBI收录号 AB124803(vvA)对应的基因序列设计的，由引物表序列F3、B3、FIP、BIP所示碱基序列的寡 核苷酸组成；其中F3为外侧上游引物，B3为外侧下游引物，FIP为内侧上游引物，BIP为内 侧下游引物。 本专利技术灵敏度高，众多研究文献表明LAMP引物相比普通PCR具有检测灵敏度高， 反应时间短的优点。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。 实施例1 现有资料显示常规临床检测海洋创伤弧菌检测（LAMP法）试剂的组成和检测方法如 下： (1) 10*反应缓冲液 (2) dNTP Mixture:10mM each (3) 甜菜碱：5mol/L (4) MgS04:150mmol/L (5) Bst 酶：8000U/mL (6) 染料：妈黄绿素4mmol/L (7) 去离子水 (8) FIP 引物 20ymol/L 碱基序列为：5' AATACCCGTGCCAGGCTTTCCTGACGCCAAAATTGTCCGIT 3 (SEQ ID N0:5); BIP 引物 20ymol/L 碱基序列为：5' AGCTGGITCCAGAGITGGGCGGGTITCACCCAAAGGTCGT' 3 (SEQ ID N0:6); F3 引物 5 ymol/L 碱基序列为：5' CAACGTCAGATGGTTTTA' 3 (SEQ ID N0:7); B3 引物 5 ymol/L 碱基序列为：5' GCrmTTCGGTGTGTAACC' 3 (SEQ ID N0:8); (9)阳性对照 DNA 10 ymol/L ※丄：组成 Tris-HCl (PH 8.8) 200mM KC1 lOOmM (NH4) 2S04 lOOmM MgS04 20mM Triton X-100 1% ※2:阳性对照DNA，是用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp)重 组入当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测海洋创伤弧菌试剂盒，包括下列组分：（1）10*反应缓冲液 2.5μL（2）dNTP Mixture 10mM each 3.5μL（3）甜菜碱 5mol/L 4μL（4）MgSO4 150mmol/L 1μL（5）Bst酶 8000U/mL 1μL（6）钙黄绿素 4mmol/L 1μL（7）去离子水 4μL（8）引物FIP引物 20μmol/L 2μL BIP引物 20μmol/L 2μLF3引物 8 μmol/L 1μLB3引物 8 μmol/L 1μL（9）阳性对照DNA 10μmol/L 2μL；所述10*反应缓冲液组成如下Tris‑HCl缓冲液 PH 8.8， 200mMKCl 100mM(NH4)2SO4 100mMMgSO4 20mMTriton X‑100 1%；所述的FIP引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；所述的BIP引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示； 所述的F3引物的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；所述的B3引物的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡成进，张永英，甘宜梧，
申请(专利权)人：胡成进，
类型：发明
国别省市：山东;37
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