本发明专利技术提供了红枣中链格孢菌的多重PCR检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的检测方法特征在于将霉变红枣上刮下的菌丝洗涤干燥后采用提取试剂盒提取基因组DNA，然后采用引物Alt-F1/ Alt-R1或Alt-F2/ Alt-R2或Alt-F1/ Alt-R1混合Alt-F2/ Alt-R2进行PCR扩增，最后经电泳鉴定。本发明专利技术提供的多重PCR检测方法可以弥补以上不足，提供一种链格孢菌快速高效的检测方法。多重PCR扩增结果表明：采用本发明专利技术特异引物检测的方法灵敏度高和特异性好，为红枣霉变的实时监测和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于果蔬加工、食品安全等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及红枣中链格孢菌的多重PCR快速检测方法与应用，属于生物
技术介绍
率(Zizyphus jujuba Mill)属鼠李科率属植物，是一种药食同源的食品。但红率在自然条件下贮藏容易发生真菌病害侵染引起的霉变，在霉变过程中，真菌产生的真菌毒素具有很强的毒性，会给食用者带来危害，链格孢菌是红枣霉变中的主要真菌之一，因此，对其进行快速准确的检测，对控制红枣产品的安全性具有重要意义。传统的，链格孢菌常用分离培养和血清学方法，分别采用不同的检验程序、方法，分别报告，确诊检验结果至少需5?7d，检验方法繁琐、时间长、特异性低等，因此，快速、准确、简便的链格孢菌检测方法将是发展的方向。建立一种快速检测霉变红枣中链格孢菌的检测方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用枣中链格孢菌特菌Alt-FURl扩增片段和Alt_F2，R2扩增片段设计引物，采用多重PCR对其进行鉴定，旨在为枣产品的检测链格孢菌检测提供一种快速、准确、简便新方法本专利技术的技术方案如下:一种枣中链格孢菌特菌多重PCR检测方法，采取如下步骤:(I)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；(2)从红枣真菌菌丝中提取基因组DNA，作为PCR反应的模板，分别用Alt_Fl、Rl扩增片段和Alt-F2，R2扩增片段设计的引物进行PCR，PCR反应体系为50 μ L:DNA模板2 μ L ; 10 X 缓冲液 5 μ L ；dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;引物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L ;无菌水补足至50 μ Lo PCR反应程序为:95°C预变性5min，然后94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后取5yL PCR产物加I yL6X溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上IlOV电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。本专利技术的有益效果是:链格孢菌是影响红枣霉变的重要因素，霉变红枣对消费者的身体健康造成危害，而传统的链格孢菌细菌培养、血清学、生化鉴定等检测方法检测周期长(需4?7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度低，不能起到有效地监测和预防作用。本专利技术提供的多重PCR检测方法可以弥补以上不足，提供一种链格孢菌快速高效的检测方法。多重PCR扩增结果表明:采用本专利技术特异引物检测的方法灵敏度高和特异性好，为红枣霉变的实时监测和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于果蔬加工、食品安全等领域。【附图说明】图1 为 Alt-Fl，Rl 引物特异性，M:DL 1000 DNA Marker ；1:XZJ1 ；2:XZJ2 ；3:扩展青霉；4:皮落青霉；5:根霉；6:毛霉；7:黑曲霉；8:链孢霉；9:长梗木霉；图 2 为 Alt-F2，R2 引物特异性，M:DL 1000 DNA Marker ；1:XZJ1 ；2:XZJ2 ；3:扩展青霉；4:皮落青霉；5:根霉；6:毛霉；7:黑曲霉；8:链孢霉；9:长梗木霉。【具体实施方式】实施例1 一种链格孢霉多重PCR快速检测方法，采用多重PCR技术一次性扩增沙门菌和大肠杆菌078的特异基因以及细菌16s rDNA的部分序列，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。本实施例所用主要试剂:Tap酶、dNTP:均购自TaKaRa公司。真菌DNA提取试剂盒，Omega公司。本实施例所用主要仪器:5311 型 PCR 仪，德国 eppendorf 公司；DYCP-31DN水平电泳仪(北京六一仪器厂)；Tanon-2500R全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤:(I)合成引物根据链格孢霉特异基因设计特异引物Alt-Fl/Alt-Rl，上述引物的核苷酸序列为:Alt-Fl 5-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3Alt-Rl 5-CGACTTGTGCTGCGCTC-3(2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；(3)多重PCR扩增反应体系的建立用Alt-Fl/Rl引物进行PCR，PCR反应体系为50yL:DNA模板2yL;10X缓冲液 5 μ L ；dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;弓I 物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0.4yL ;无菌水补足至50 μ L。PCR反应程序为:95 °C预变性5min，然后94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后取5 yLPCR产物加I yL 6X溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上IlOV电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。实施例2本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1。上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤:(I)合成引物根据链格孢霉特异基因设计特异引物Alt-F2/Alt-R2，上述引物的核苷酸序列为:Alt-F2 5-CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC-3Alt-R2 5-CAGGCATGCCCTTTGGATAC-3，(2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；(3)多重PCR扩增反应体系的建立用Alt-F2/R2引物进行PCR，PCR反应体系为50 μ L:DNA模板2 yL ;10X缓冲液 5 μ L ；dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;弓I 物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0.4yL ;无菌水补足至50 μ L。PCR反应程序为:95 °C预变性5min，然后94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后取5 yLPCR产物加I yL 6X溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上IlOV电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。实施例3本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1。上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤:(I)合成引物根据例I和例2分别合成引物Alt-Fl/Alt-Rl和Alt_F2/Alt_R2，将2对引物按Alt-Fl/Alt-Rl:Alt-F2/Alt-R2 体积比比 3:1 的比例混合。(2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；(3)多重PCR扩增反应体系的建立用混合引物进行PCR，PCR反应体系为50 μ L:DNA模板2 μ L ; 10 X缓冲液5 μ L ;dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;引物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L ;无菌水补足至50 μ L。PCR反应程序为:95°C预变性5当本文档来自技高网...
【技术保护点】
红枣中链格孢菌的多重PCR检测引物，其特征在于：根据链格孢霉特异基因设计特异引物Alt‑F1/Alt‑R1，所述引物的核苷酸序列为：Alt‑F1 5‑TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT‑3Alt‑R1 5‑CGACTTGTGCTGCGCTC‑3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郝莉花，王勇，吴晓宗，董彩文，丁太春，殷柯柯，纵伟，刘燕，周博，
申请(专利权)人：河南省产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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