本发明专利技术公开了一种芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）巢式PCR检测方法，以样品DNA为模板，疫霉菌Ypt1基因通用引物ph1F /Yph2R进行巢式PCR第1轮扩增，再以巢式PCR第1轮扩增产物为模板，通过设计的一对鉴别芋疫霉菌的特异性引物PCOF/PCOR进行巢式PCR第2轮特异性扩增；第2轮扩增产物经凝胶电泳检测，如果存在327bp的DNA特异性条带，即为检测出芋疫霉菌，否则未检出。本发明专利技术所提供的芋疫霉菌巢式PCR检测方法具准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，可用于田间芋头疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，克服了传统检测和鉴定方法步骤繁琐、周期长等问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物及其应用；专用于芋头疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于芋头疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治
技术介绍
由芋疫霉菌（Phytophthoracolocasiae）侵染引起的芋头疫病是芋头栽培中的主要病害之一，在芋头产区广泛分布与发生。该病初侵染主要来源于带菌的种苗和遗留田间的病株，一般4月份开始零星发生，6-9月盛行，发病率一般为20%-35%，主要危害叶片、叶柄，严重时亦危害球茎，遇高温、雨天病斑快速发展，导致叶片大量腐烂、植株折倒枯死，造成芋头产量和品质下降，芋头受害之后，产量损失高达30%-40%。近年来，随着种植结构的调整及经济效益的提升，芋头种植面积不断扩大，但是由于连年种植，芋疫病呈逐年加重趋势。芋疫霉菌具有很强的侵染性，一旦扩散蔓延则难以控制，如果能够在芋疫霉菌感染早期，及时、准确地进行检测鉴定，可以做到提前预防，如选择敏感有效的杀菌剂，对控制病情的流行大暴发具有重要意义。因此，建立一种能够快速、准确的监测和鉴别芋疫霉菌的检测方法对于我国芋头的安全生产具有重大的意义。植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有学者主要利用rDNA/ITS序列设计特异引物来对植物病原菌进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。目前用于疫霉菌分子检测的靶标基因主要有elicitin基因、β-tubulin、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等。已有研究表明，疫霉属中的Ras家族相关的Ypt1编码基因含有多个外显子和内含子，外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的特异性分子检测、鉴定，目前尚无针对该靶标基因设计的特异性芋疫霉菌PCR检测引物的报道。本专利技术通过对疫霉属（Phytophthora）及其亲缘较近的Ypt1基因序列进行比对分析，设计出1对可用于特异性检测芋疫霉菌的PCR引物，为芋疫霉菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地对芋头疫病采取防治措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对芋疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有分子检测中rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将一些近缘种的病原菌区分开的技术缺欠，提供了芋疫霉菌特异性PCR检测引物及其检测方法，利用本专利技术所述的PCR检测引物和检测方法检测芋疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1．芋疫霉菌巢式PCR特异性引物：通过测定芋疫霉菌（Phytophthoracolocasiae）和其它疫霉菌（Phytophthoraspp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对芋疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：上游引物PCOF：5'-AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA-3'，下游引物PCOR：5'-AATCTCATGCAGCCACTGCT-3'；对芋疫霉菌特异性扩增出327bp的产物。2.一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60µLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/µL待用。用于检测芋头组织中存在芋疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL0.5mol/LNaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0µL作为PCR模板进行扩增；用于检测土壤样品中存在芋疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。（2）巢式PCR第1轮扩增：所用引物为：ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'，Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'；以步骤（1）提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物对ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增；PCR反应体系25µL：2×TaqPCRMasterMix12.5µL，10µmol/L的ph1F/Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25µL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火30S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min；（3）第2轮PCR扩增：所用引物对为权利要求1所述的PCOF/PCOR，待步骤（2）第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl第一轮PCR扩增产物稀释1-100倍为模板；PCR反应体系25µL：2×TaqPCRMasterMix12.5µL，10µmol/L的PCOF/PCOR引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25µL；PCR条件为：扩增参数为95℃预变性5min，94本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：PCOF：5'‑ AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA ‑3'，PCOR：5'‑ AATCTCATGCAGCCACTGCT ‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：PCOF：5'-AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA-3'，PCOR：5'-AATCTCATGCAGCCACTGCT-3'。2.一种利用权利要求1所述引物进行巢式PCR检测芋疫霉菌的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）巢式PCR第1轮扩增：所用引物为：ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'，Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'；以步骤（1）提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物对ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增；PCR反应体系25µL：2×TaqPCRMasterMix12.5µL，10µmol/L的ph1F/Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25µL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火30S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min；（3）巢式PCR第2轮PCR扩增：所用引物对为权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰成忠，吴玮，阮宏椿，姚锦爱，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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