AS-PCR引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种AS-PCR引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒，所述方法及试剂盒用于对可能包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在。所述AS-PCR引物设计方法包括以下步骤：(i)针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；(ii)对步骤(i)所设计的AS-PCR引物进行修饰，在引物5’端1～8个碱基内标记一荧光基团，对等位基因变异区域的碱基用淬灭基团标记；(iii)在步骤(ii)所设计的AS-PCR引物3’端额外合成1～3个与待测基因不互补的碱基。相较于传统AS-PCR单一的检测位点能力，本发明专利技术的基因多态性引物设计方法和检测方法及试剂盒可以兼并识别突变位点,并且可以将探针和引物合二为一，节约了引物合成成本、设计时间，设计也方便易懂，容易掌握。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸诊断试剂领域，具体涉及一种改进的等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)引物设计方法。本专利技术还涉及一种改进的AS-PCR基因多态性检测方法及试剂盒，所述方法及试剂盒用于对可能(即怀疑)包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在。
技术介绍
等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specificoligonucleotide,ASO)是基于杂交的突变检测技术，常用以检测已知突变。设计一段例如15～20bp的寡核苷酸片段，其中包含了发生已知突变的部位，以此为探针，当与固定在膜上的样品DNA杂交时，由于一个碱基的差异会导致Tm值下降5～7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可以鉴定出样品DNA中是否存在突变。将ASO与PCR相结合的等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)是目前一种常用于分析基因多态性，特别是单核苷酸多态性(SNP)的方法。多态性(polymorphism)是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(geneticpolymorphism)或基因多态性。从本质上来讲，多态性产生于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。单核苷酸多态性(SNP)，即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失、插入和置换，其中以单个碱基置换的情形居多。SNP是目前倍受关注的一类多态性，由于其经常在遗传疾病、疾病易感性、药物不良反应性等研究中具有遗传标记的作用，因此，其检测为疾病诊断和早期诊断，药物学研究等提供了巨大的潜在可能。在AS-PCR中，PCR的引物之一或者两个引物被设计成在序列变异的位点处退火，使其能够区分同一基因的不同等位基因，这些等位基因类型包括碱基的替换、插入和缺失。AS-PCR利用了DNA聚合酶的保真度：相比于3’端最后一个碱基正确匹配引物而言，3’端最后一个碱基错配的引物在延伸效率上大大降低(通常为1/100至1/100,000)。3’端最后一个碱基错配的引物由此导致延伸困难，PCR扩增减少，因此很容易通过检测区分突变。传统AS-PCR的引物3’端最后一个碱基特别关键，必须为基因多态性位点。以检测SNP为例，其原理如图1所示。图1A中，针对包含SNP位点的靶序列设计等位基因特异性引物(下称AS引物)1-1、1-2，即，在常规PCR引物设计基础上，使待测SNP位点恰好位于AS引物1-1、1-2的3’末端，即引物1-1与1-2仅3’末端的碱基不同(分别对应野生型和可能的突变型)，其余碱基序列一致，其中5’端X代表碱基上的羟基或磷酸基，3’端Y代表碱基上的羟基。图1B中，2-1和2-2分别为等位基因所在的野生型和突变型DNA双链，其中2-1b和2-2b分别为与AS引物配对的模板链。如图1C所示，按照3’端最后一个碱基严格互补配对的原理，实现等位基因的特异性扩增。也就是说，若图1A中的AS引物与图1B中的模板完全互补配对，则形成图1C中3-1、3-2所示双链结构，PCR反应顺利进行，若形成图1C中3-3、3-4所示情况，3’末端碱基错配，则PCR反应不可进行。通过分析PCR扩增结果，判定SNP情况，若引物1-2扩增而引物1-1无明显扩增，则表明存在所述突变。传统AS-PCR对DNA聚合酶的要求比较高。PCR(非AS-PCR)反应体系中常用的DNA聚合酶有A型和B型两种，A型DNA聚合酶具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，如TaqDNA聚合酶等；B型DNA聚合酶不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，还具有3’端到5’端的DNA外切酶活性，可以即时识别并切除3’端的错配碱基(因错配导致翘起)，从而剩下未错配的碱基得以继续扩增，例如pfuDNA聚合酶、KODDNA聚合酶，等等。由于传统AS-PCR正需要利用多态性位点的错配引物，故而扩增反应中仅能使用A型DNA聚合酶，不能使用会将错配碱基切除的B型DNA聚合酶。图2A和2B示意性地示出了A型和B型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况。其中，图2A是A型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况，当引物(3’端为羟基)与模板完全匹配时，在A型DNA聚合酶作用下引物得以扩增(左)，而当引物3’端与模板错配时，退火温度下错配部分翘起，不能与模板结合，A型DNA聚合酶不起作用，引物不能扩增(右)，利用此特性，传统AS-PCR得以实现等位基因多态性的检测；图2B是B型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况，当引物与模板完全匹配时，在B型DNA聚合酶作用下引物得以扩增(左)，而当引物3’端与模板错配时，错配部分翘起，B型DNA聚合酶先发挥3’端到5’端的DNA外切酶作用，将错配部分切除，剩下未错配的引物在DNA聚合酶作用下得以继续扩增(右)，这样显然无法用于传统AS-PCR中鉴别等位基因多态性。传统AS-PCR技术存在以下缺点：第一、由于AS引物要针对待测突变型进行设计，故而传统AS-PCR技术仅能对已知的多态性位点进行检测，不能检测未知的突变类型。第二、传统AS-PCR技术在检测扩增结果方面，一种是采用电泳分析方法，这种方式操作复杂费时，成本高，且技术较难普及；另一种是采用实时荧光定量PCR，这也需要额外合成标记有荧光基团和荧光猝灭基团的荧光探针。因此，业界存在改良传统AS-PCR技术的需要。在属于同一权利人的中国专利技术专利ZL201410106312.0中，提出了一种新的AS-PCR技术，其中对AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团，并且使用B型DNA聚合酶进行的PCR反应，使得所述经修饰的AS-PCR引物在与模板链错配时延伸，而与模板链互补时不延伸。由于上述设计的AS-PCR引物3’端具有能够屏蔽引物直接延伸的基团，当与模板DNA结合时，若引物与模板完全互补，由于引物的3’进行了去羟基化修饰，无法与dNTP发生聚合反应，因此引物不延伸。反之，若引物与模板错配，即不完全互补，则退火时错配部分翘起不与模板结合，此时B型DNA聚合酶的3’端到5’端外切酶活性起作用，将引物3’端翘起的不互补配对的部分切除，剩余引物部分的3’端羟基露出(DNA链上dNTP之间的磷酸二酯键在B型DNA聚合酶作用下水解后，引物3’端产生羟基，水解下的dNTP或DNA链的5’端形成磷酸基)，如此，酶切后的引物即可在DNA聚合酶作用下延伸。图3A和3B示意性地示出了B型DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种AS‑PCR引物的设计方法，所述方法包括以下步骤：(i)针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS‑PCR引物；(ii)对步骤(i)所设计的AS‑PCR引物进行修饰，在引物5’端1～8个碱基内标记一荧光基团，对等位基因变异区域的碱基用淬灭基团标记；(iii)在步骤(ii)所设计的AS‑PCR引物3’端额外合成1～3个与待测基因不互补的碱基。

【技术特征摘要】
1.一种AS-PCR引物的设计方法，所述方法包括以下步骤：
(i)针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；
(ii)对步骤(i)所设计的AS-PCR引物进行修饰，在引物5’端1～8个碱基内标记一荧光
基团，对等位基因变异区域的碱基用淬灭基团标记；
(iii)在步骤(ii)所设计的AS-PCR引物3’端额外合成1～3个与待测基因不互补的碱
基。
2.一种AS-PCR基因多态性检测方法，所述方法用于对可能包含等位基因变异区域的靶
序列进行检测以确定等位基因变体是否存在，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(i)针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；
(ii)对步骤(i)所设计的AS-PCR引物进行修饰，在引物5’端1～8个碱基内标记一荧光
基团，对等位基因变异区域的碱基用淬灭基团标记；
(iii)在步骤(ii)所设计的AS-PCR引物3’端额外合成1～3个与待测基因不互补的碱
基；
(iv)使用步骤(iii)所修饰的AS-PCR引物对所述靶序列进行PCR扩增，所述PCR扩增使
用B型DNA聚合酶；

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小芳，李丙亮，
申请(专利权)人：李丙亮，
类型：发明
国别省市：上海;31