用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；检测方法包括：对反应置于60℃至65℃的反应环境中并以1℃递增进行优化，从多次重复试验中确定最佳反应温度；在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃ 1min；循环阶段63℃ 15s，63℃ 45s，60个循环；于63℃ 45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。本发明专利技术使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作简便，容易标准化，易于推广使用。

【技术实现步骤摘要】
用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法
本专利技术属于虾黄头病病毒检测
，尤其涉及一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法。
技术介绍
黄头病(YellowHeadDisease，YHD)是由黄头病毒(YellowHeadVirus，YHV)引起的对虾传染性疾病，黄头病毒属于套式病毒目(Nidovirales)杆套病毒科(Roniviridae)头甲病毒属(Okavirus)的单链RNA病毒，因濒死虾头胸部因肝胰腺发黄而变成黄色，被称为黄头病。黄头病毒传染率很高，且从对虾感染到死亡经历的时间只有几天时间，给水产养殖人员带来了巨大的经济损失。1992年，泰国因对虾感染了黄头病毒导致减产五千吨，经济损失重大。该病在感染初期的2～4天时会出现不正常的大量进食的现象,而后几乎完全停止进食,接下来便会发现有大量垂死的虾只会聚集在养殖池的池水表面或池塘周围，在严重发病时可使全池的虾在3天内基本全部死亡，死亡率很高。我国将其列为二类疫病，世界动物卫生组织(OfficeInternationaldesEpizooties，OIE)将其列为必须申报的疫病。已知的黄头病毒群有六种，分为YHV(YHV-1型)、鳃联病毒(Gill-associatedvirus，GAV)(YHV-2型)及其它4种基因型(YHV-3型–YHV-6型)。其中YHV-3型–YHV-6型常见于东非、亚洲和澳大利亚的健康的斑节对虾，表现为极少或从不引发疾病。YHV可以在海水中存活三天以上，在60℃下15分钟可以将其灭活。至今为止，国内外对于YHV的检测方法目前并不多，其中分子学检测方法主要为液相基因芯片法和RT-PCR法，OIE《水生动物诊断手册》(OIE，2012)推荐的为RT-PCR法，但需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大。而实时荧光RT-PCR技术的发展，使病毒检测技术得到了进一步提高，这种检测技术也被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中。实时荧光RT-PCR技术进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测，但TaqMan荧光RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高。综上所述，现有的虾黄头病病毒的检测方法存在步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，旨在解决现有的虾黄头病病毒的检测方法存在步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大，成本较高的问题。本专利技术是这样实现的，一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物，所述用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中下载YHV基因组序列，进行多序列比对，寻找YHV的一段保守基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMPDesigner1.1.4设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用DEPC水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述用于检测虾黄头病毒荧光LAMP引物的用于检测虾黄头病毒的检测方法，所述用于检测虾黄头病毒的检测方法包括以下步骤：步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit(200)说明书提取样品核酸；步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，BstDNApolymerase0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，RNA模版2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；步骤三，仪器检测：对反应置于60℃至65℃的反应环境中并以1℃递增进行优化，从多次重复试验中确定最佳反应温度；在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃1min，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。本专利技术提供的用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，该引物能与靶序列上的6个特定区域结合，因此特异性高于传统的荧光PCR方法；而且没有探针的加入，使得成本大大降低。本专利技术旨在建立一种快速、准确、简单易操作的虾黄头病毒检测方法；环介导等温扩增技术(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本Notomi等在2000年报道的一种新的核酸扩增技术。与传统的扩增技术相比，该技术扩增的特异性更强，反应过程只需在60～65℃的恒温条件下30～60min即可完成，不需要热循环。由于反应过程中不需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性，并且具有重复性好、特意性强、敏感度高和易于操作等特点。本专利技术是在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。附图说明图1是本专利技术实施例提供的用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的黄头病毒OIE方法临床试验示意图；图中：1-10：虾样品；M：DL-2000DNAMarker；N：阴性对照；P：阳性对照。图3是本专利技术实施例提供的黄头病毒LAMP检测方法建立示意图；图中：P阳性对照；N：阴性对照。图4是本专利技术实施例提供的黄头病毒LAMP方法特异性试验示意图；图中：1-10：虾组织样品；N：阴性对照；P：阳性对照。图5是本专利技术实施例提供的黄头病毒LAMP方法灵敏度检测示意图；图中：1-9：拷贝数梯度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101；N：阴性对照。图6是本专利技术实施例提供的检测方法稳定性试验1示意图。图7是本专利技术实施例提供的检测方法稳定性试验2示意图。图8是本专利技术实施例提供的样品检测结果示意图；图中：1-10：虾样品；N：阴性对照；P：阳性对照。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图及具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步描述。本专利技术实施例提供的用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：SEQIDNO：1FIPTCATAGACGCCTTCTGGACAGACACAGTCATTCGCATTACAAGSEQIDNO：2BIPTATCGTCCCGGCAATTGTGATCAACCAGTGACGTTCGATGSEQIDNO：3F3CAACATCCTCAAGATGGACATSEQIDNO：4B3GAATTGTCATGTCTTCATGTGGSEQIDNO：5LFT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物，其特征在于，所述用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物，其特征在于，所述用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6。2.一种如权利要求1所述的用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤：按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中YHV的YHV-1型—YHV-6型的基因组序列，经多序列比对，以ORF1基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMPDsigner1.1.4设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用超纯水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。3.一种利用权利要求1所述用于检测虾黄头病病毒的检测方法，其特征在于，所述用于检测虾黄头病病毒的检测方法包括：步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit200说明书提取样品核酸；步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：薄清如，罗宝正，赵福振，陈轩，廖秀云，成晓维，徐海聂，陈敬，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44