本发明专利技术公开了一种检测屎肠球菌的试剂盒及方法，属于PCR检测领域。本发明专利技术的试剂盒包括用于检测屎肠球菌特异性引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。本试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的特点，具有良好的标本检测能力。为快速，准确检测屎肠球菌提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及菌株检测领域，特别涉及检测样品中屎肠球菌或者含有屎肠球菌DNA 的方法以及用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。
技术介绍
屎肠球菌（EnterococcusFaecium)是一种常见的病原菌。目前屎肠球菌的检测 主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。传统生理生化耗时耗力，不能满足实际检 测的需要。基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于 转基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于屎肠球菌的检 测，但普通PCR需要凝胶电泳判断结果，耗时耗力。另外，而不同实验室之间由于仪器、人 员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条件，导致检测特异性受到影响，可能照成误 判。SYBRGreenI是一种小分子DNA染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双 链DNA特异地结合时，荧光染料掺入DNA双链，发射出强烈的荧光信号，同时PCR产物的特 异性可以用熔解曲线分析进一步确认，利用SYBRGreenI这一特性建立的实时荧光PCR在 植物病原菌检测方面已广泛应用。DPO(Dualprimingoligonucleotide)引物技术的主要 原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5'端序列由18-25个碱基组成并与 靶基因序列配对，3'端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的 特异性区域利用寡聚次黄嘌呤（Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温 度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5'和3'区域形两个独立功能 的双特异性引物结构，并且研究表明5'和3'引物区域中任何有3个及以上碱基的错配， PCR反应将不能进行。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性 和实用性强的基于DP0引物的实时荧光PCR用于检测屎肠球菌方法，本专利技术还提供了用于 该方法的DP0引物和含有该DP0引物的试剂盒。 为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现： 基于DP0引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DP0引物， 所述DP0 引物上游引物EF-DP0-F设为SEQIDNO. 1，5'-GGCGGACATGCTAACCATTCAIII IICTGGGAAATC-3'，下游引物EF-DP0-R设为SEQIDΝ0· 2，5'-CCATCAATGGAGAATCTTGATTT GIIIIIGAGGTAATAGCHy，其中I碱基为次黄嘌呤。 一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括如下步骤： (1) 待测细菌样品基因组DNA的提取； (2) 实时荧光PCR反应：以含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时荧光PCR反应， 所述DPO引物为SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 ; (2)判断待检样品。 所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：所述实时荧光？〇?反应的程序如下：95°(：预变性308、95°(：变性58、50-60°(：退火308、 72°C延伸30s，35个循环。优选的，所述的退火温度为55°C。 一种基于DP0引物或至少包含DP0引物的细菌样品检测试剂盒。 本专利技术的有益效果包括：（1)本专利技术针对屎肠球菌的SodA基因设计特异性DP0引 物，建立了实时荧光PCR法；（2)本专利技术将SYBRGreenI实时荧光PCR和DP0引物检测技 术相结合，吸收了DP0引物高特异性且引物之间难以形成二聚体等优点，成功建立了一种 特异性强、灵敏度高的屎肠球菌的检测方法；（3)本专利技术的DP0引物的特异性在较低退火温 度（50°C)和较高的退火温度下（60°C)下结果一致，这大大增强了本专利技术的DP0引物和方 法在不同实验室之间的通用性；（4)本专利技术将DP0引物和SYBRGreenI的实时荧光PCR结 合起来，检测结果易于判断，无需凝胶电泳，这也增强了本方法的实用性。【附图说明】 下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。 图1为特异性图；其中1-10分别为为屎肠球菌（ATCC 35667)、粪肠球菌（ATCC 29212)、溶藻弧菌（ATCC 17749)、副溶血弧菌（ATCC17802)、奇异变形杆菌（ATCC 29245)、 大肠杆菌（ATCC 11229)、单增李斯特菌（ATCC 7644)、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213)、伤寒 沙门氏菌（ATCC 14028)、枯草芽孢杆菌（ATCC 21332)。 图 2 为灵敏度图；1-6 分别为 100ng/yL、10ng/yL、lng/yL、0.lng/yL、0. 01ng/yL、 0.OOlng/μL〇【具体实施方式】 除非特殊说明，本专利技术所用术语具有本专利技术所属领域中的一般含义。 本专利技术通过检测屎肠球菌的SodA基因来检测样品中的屎肠球菌。由此，运用本方 法可以快速的检测出样品中的屎肠球菌。 本专利技术检测屎肠球菌的SodA基因是通过实时荧光定量PCR来实现的。 为了实现上述目的，本专利技术针对屎肠球菌的SodA基因设计了特异性DP0引物。 在一个具体实施例中，所用的特异性DP0引物包含SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列。 本专利技术DP0引物的特异性在较低退火温度（50°C)和较高的退火温度下（60°C) 下的结果一致，这大大增强了本方法在不同实验室之间的通用性。 在一个具体方面，本专利技术涉及一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括： (1) 实时荧光PCR反应 以含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时荧光PCR反应，所述DP0引物为SEQID N0:1和SEQIDN0:2 ; (2) 判断待检样品 在步骤（1)之前还可以包括DNA的提取步骤。 所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下： 所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：所述实时荧光PCR反应的程序如下： 95°C预变性 30s;95°C变性 5s、50-60°C退火 30s、72°C延伸 30s，35 个循环。 下面参考具体实施例和附图，对本专利技术进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅 是说明性的，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领 域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂 商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 实施例1、本实施例提供了样品中屎肠球菌的检测方法，包括如下步骤： 步骤一：基因组DNA的提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司，货号为DP302) 对样品提取DNA，参照说明书的要求操作。 步骤二：实时荧光PCR反应 实时荧光PCR反应体系如下：当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于DPO引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DPO引物，其特征在于，所述DPO引物上游引物LR‑DPO‑F设为SEQ ID NO.1，5′‑ GGCGGACATGCTAACCATTCAIIIIICTGGGAAATC ‑3′，下游引物LR‑DPO‑R设为SEQ ID NO.2，5′‑CCATCAATGGAGAATCTTGATTTGIIIIIGAGGTAATAGC ‑3′，其中I碱基为次黄嘌呤。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟茹，粟有志，尚爽，魏霜，
申请(专利权)人：中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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