多重等位基因检测制造技术

本文提供了涉及核酸检测的技术和特别地，但不排他地，涉及用于同时检测多个核酸的方法和组合物的技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】多重等位基因检测 本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/792, 202的 优先权，该临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。 专利
本文提供了涉及核酸检测的技术并且特别地，但不排他地，涉及用于同时检测多 个核酸的方法和组合物的技术。 专利技术背景 单核苷酸多态性（SNPs)的检测可用于生物医学领域例如人类遗传学、癌症诊断学、药 物遗传学和微生物基因分型。通常，许多常见的技术用等位基因特异性引物检测SNPs，所述 等位基因特异性引物设计为具有有效延伸特异性的SNP模板而非野生型模板或其它非靶 SNP序列。由于其特异性，相对于其它技术例如等位基因特异性探针，这类等位基因特异性 引物通常优选用于SNP检测。然而，使用等位基因特异性引物的PCR和实时PCR方法局限 于其多重性能力，这是因为扩增产物的检测基于与共有序列结合的探针，或基于不具有充 分区分小的核苷酸变更例如个别SNPs的能力的技术。 -些常规的解决方案使用在其:V末端包含SNP-检测核苷酸的等位基因特异性 引物和引物特异性杂交标签（美国专利号6, 794, 133)。然而，这项技术取决于固相技术， 并且具有危及其对于实时PCR的效用的引物特异性问题。其他常规的单体型分析解决方案 提供了使用在其3'末端包含SNP-检测核苷酸的等位基因特异性引物的多重检测，但SNPs 的检测通过大小而非通过实时PCR荧光信号完成（国际专利公布号W0 2008143367)。最 后，一些现存常规技术使用通用引物序列进行多重分析，但检测通过电泳进行，并且不提供 多重实时PCR(美国专利号6, 207, 372、5, 882, 856)。因此，在生物医学领域存在对使用等位 基因特异性引物的多重SNPs的多重PCR检测的需求。 专利技术概述 本文提供了涉及使用等位基因特异性引物进行核酸序列多重检测的技术。例如，提供 了用于在一个检测反应（例如，PCR，如，实时PCR)中同时检测多个SNPs的方法的实施方 案。在一些实施方案中，所述技术在本文中被称为多重等位基因特异性引发检测（Masp)和 FRET-介导的多重等位基因特异性引发检测（F-Masp)。 在一些实施方案中，并且随着该技术可用在一些应用中，F-Masp相对于Masp在其 探针的使用方面提供了一种或多种优势，在一些实施方案中，如果需要，所述探针为该技术 提供了额外的特异性。例如，在一些测定中，F-Masp减少或消除来自非特异性信号的干扰， 例如，来自非特异性引发、引物二聚体的形成和/或包含相同或相似靶序列的非靶向区（例 如，假基因）的存在。 本文所提供的该技术允许从一个均一扩增反应检测、鉴定和/或报告多个SNPs或 基因型。因此，该技术为临床医生和患者更加有效提供信息、改善测定流程并提供一种所需 的技术。 该技术，在一些实施方案中，提供用于检测样品中的核酸（例如，包含BRAF基因或 部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋 白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf 蛋白的BRAF突变的核酸）的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态的引物接 触；和如果引物与核酸杂交并产生扩增产物，则检测来自可检测状态的引物的信号，其中检 测到信号时，在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，所述猝灭状态的引物包含双链的双 链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述引物包含荧光团， 并且当引物在猝灭状态下时荧光团被猝灭剂猝灭。所述技术不限制与寡核苷酸连接的荧光 部分、猝灭剂部分和FRET对。例如，一些实施方案提供一种方法，其中荧光团为FAM、TET、 JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝灭剂为 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。 在一些实施方案中，可检测状态的引物与核酸杂交；在一些实施方案中，猝灭状态 的引物通过聚合酶掺入到核酸链中。在一些实施方案中，猝灭状态的引物通过聚合酶掺入 核酸链中并且引物保留双链的双链体区域；然后，在一些实施方案中，当丧失双链的双链体 区域时，例如，当合成置换双链的双链体区域的互补链时引物处于可检测状态。 所述技术的引物以多种形式提供。例如，在一些实施方案中猝灭状态的引物由包 含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成。在一些实施方案中，猝灭状态的引物由包含荧光 团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸 杂交。在一些实施方案中，未激发状态的引物由包含荧光团的第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。 在一些实施方案中，所述技术的引物通过聚合酶（例如，在PCR期间）或另一合成 过程掺入到核酸中。在一些实施方案中，被掺入的引物处于可检测状态、猝灭状态或未激发 状态。因此，在一些实施方案中扩增子包含可检测状态的引物。所述技术的引物以多种形 式提供。例如，在一些实施方案中，所述引物为茎-环引物或双链线性引物。在一些实施方 案中，所述引物为等位基因特异性引物。 在一些实施方案中，所述技术进一步包括用聚合酶和核苷酸延伸可检测状态的引 物，并且在一些实施方案中所述技术进一步包括进行聚合酶链反应，例如，在一些实施方案 中所述聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。 在一些实施方案中所述方法为用于检测超过一个核酸（例如，超过一个包含BRAF 基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的 B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换 的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸），例如，超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多重方 法。因此，在一些实施方案中所述方法包括使包含第二核酸的样品与猝灭状态的第二引物 接触；和如果第二引物与第二核酸杂交并产生扩增产物，则检测来自可检测状态的第二引 物的第二信号，其中当检测到第二信号时，在样品中检测到第二核酸。 在一些实施方案中所述技术包括使用引物和探针。例如，在一些实施方案中提供 用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态或未激发状态的 引物和探针接触；和如果探针与核酸杂交，则检测来自引物的信号，其中当检测到信号时， 在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，所述探针包含双链的双链体区域。在一些实施 方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述探针包含荧光团（例如，荧光共振能量 转移供体），并且引物包含荧光团（例如，荧光共振能量转移受体）。 所述技术的探针以多种形式提供。例如，在一些实施方案中猝灭状态的探针由包 含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成。在一些实施方案中，猝灭状态的探针由包含荧光 团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸 杂交。在一些实施方案中，未激发状态的探针由包含荧光团的第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，探针（例如，在其Y 末端）被修饰以使其不能提供通过聚合酶来延伸的底物（例如，聚合酶不能将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括：1) 使包含核酸的样品与猝灭状态的引物接触；和2) 如果：a) 引物与核酸杂交；或b) 引物与核酸杂交，并且引物被掺入扩增子中，则检测来自可检测状态的引物的信号，其中所述核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因，并且当检测到信号时在样品中检测到该核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S黄，H苏，
申请(专利权)人：雅培分子公司，
类型：发明
国别省市：美国;US