有效的非减数分裂等位基因渐渗制造技术

用于动物间的等位基因(包括SNP)的渐渗的方法、用途和动物。一个实施方案牵涉将靶向性靶向内切核酸酶系统和HDR模板导入在靶向内切核酸酶和靶定位点的结合中具有错配的细胞中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的交叉引用本申请要求2013年8月27日提交的美国临时申请No.61/870,401的优先权，其在此通过提及并入本文。政府支持的声明本文中描述的工作的方面得到来自国立卫生研究所的拨款1R43RR033149-01A1和来自USDA-国家食品与农业研究所(National Institute of Food and Agriculture)的生物技术风险评估项目竞争拨款号2012-33522-19766支持。美国政府可以具有这些专利技术的某些权利。专利

涉及用于生成经遗传修饰的细胞和动物的材料和方法，和用于其的研究工具。专利技术背景从创建第一只转基因猪起，已经记录了以多种方式遗传工程化改造家畜的超过180项试验。动物遗传工程在传统上已经通过表达盒的随机插入，或者用连接的选择标志物的同源重组(低于104之一的效率)实现，所述随机插入遭受低效率和无法预测的表达。专利技术概述已经利用三种最近的靶向性内切核酸酶技术，即锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应器核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔性短回文重复/CRISPR关联内切核酸酶cas9(CRISPR/Cas9)通过非同源末端连接(NHEJ)介导将插入和/或缺失(indel)引入物种基因组中来破坏基因功能。特别地，已经在范围为模式生物体至作物、耕作动物和人的各种物种中证明了TALEN诱导的基因破坏。然而，由NHEJ引入的indel在大小和序列上可变，这使功能性破坏的克隆的筛选变得费力，并且没有实现精确改变。TALEN或CRISPR/Cas9介导的同源性指导修复(HDR)已经支持在低等真核模型(包括酵母、斑马鱼和最近地小鼠)中引入限定的核苷酸变化。这些是容许修饰长传代细胞(long-passage cell)或原生殖细胞以生成转基因动物的模型。本文中在约15个不同的工作例中在猪、山羊和牛基因组中证明了多种基因的精确的、高频率编辑。在一些实施方案中，基因编辑物与物种或进化枝内存在的等位基因不能区分，并且代表无标志物、非减数分裂等位基因渐渗的第一次证明。在可用于农业、研究工具、或生物医学目的的家畜基因组中的某些商业上重要的基因座中实现了高效率且精确的基因编辑。这些方法已经将家畜基因编辑工具箱扩展到包含TALEN和使用质粒、rAAV和寡核苷酸模板的CRISPR/Cas9刺激的同源性指导修复(HDR)。实施例之一显示了将牛POLLED等位基因渐渗入有角(horned)Holstein成纤维细胞中。此实施例证明了可以创建没有角的各种乳牛品种。并且，此变化可以在不破坏动物的其它基因或基因组的其它部分的情况下进行。使用TALEN mRNA和寡核苷酸转染以群体中10-50％的效率将单核苷酸变化或小indel(意指替换、插入和/或取代的术语)引入猪、山羊和牛成纤维细胞中的约14个其它基因中。几个选定的编辑物模拟天然存在的性能增强或疾病抗性等位基因，包括第一次模拟单碱基对(bp)的变化。在不选择的情况下增殖的高达70％的成纤维细胞集落含有意图的编辑物，其中超过一半是纯合的。这些效率如此之高以至于这些变化可以在没有报告物的情况下和/或在没有选择标志物的情况下进行。使用编辑的成纤维细胞来产生在DAZL和APC基因中具有敲除等位基因的猪，从而分别为不育和结肠癌建模。这些方法在研究、农业和生物医学应用的家畜细胞、大型哺乳动物和家畜中证明了选择等位基因的无减数分裂物种内和物种间渐渗。下述专利申请在此通过提及并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准：US 2010/0146655、US 2010/0105140、US 2011/0059160、US 2011/0197290和US 2013/0117870。附图简述图1显示了使用TAL效应器内切核酸酶(TALEN)的一般方法。图2显示了使用Cas9/CRISPR内切核酸酶(一种RNA引导内切核酸酶)的一般方法。图3显示了TALEN运行的理论，其解释了它们为何一般对于进行SNP变化无效；类似的过程适用于其它靶向性内切核酸酶。图4显示了生成和使用有效生成SNP编辑物靶向内切核酸酶的一般方法。图5显示了生成和使用有效生成SNP编辑物靶向内切核酸酶的另一种一般方法。图6：TALEN介导的POLLED渐渗。小图a)将Polled等位基因渐渗入Holstein(HORNED)细胞中的策略的示意图。POLLED等位基因(底部)是一个具有10bp缺失(未显示)的212bp的串联重复(水平箭)。开发出TALEN以特异性靶向HORNED等位基因(垂直箭)，其可以通过使用POLLED HDR质粒的同源重组修复。小图b)具有POLLED的纯合或杂合渐渗的集落的代表性图像。使用三个引物组进行候选集落的阳性分类：F1+R1、F2+R2和F1+P(POLLED特异性)。通过测序F1+R1扩增子确认PCR产物的身份。图7是为了评估经转染的mRNA作为TALEN的来源而产生的实验数据的图。将由未修饰的mRNA、经修饰的mRNA(mod mRNA)或质粒DNA(pDNA)编码的TALEN导入成纤维细胞中。将两个量的每种TALEN制备物转染到细胞中，随后将细胞于30℃或37℃培养3天，之后分析indel，以％NHEJ报告。图8A的图显示了使用寡核苷酸供体，TALEN的mRNA来源刺激有效并且一致的HDR。每幅图展示使用寡核苷酸供体模板和以质粒DNA或mRNA投递的TALEN靶向成纤维细胞中的特定基因座(例如ssIL2RG；“ss”代表野猪(Sus scrofa)以及“bt”代表欧洲牛(Bos taurus))的结果。(插图)寡聚物模板的图，其中有阴影的框代表TALEN结合位点，并且间隔物以白色显示。每个寡聚物含有4-bp插入(ins4)或缺失(del4)，其引入用于RFLP分析的新限制性位点。推定的BM用指定的核苷酸替换保守的-1胸苷(相对于TALEN结合位点)。用TALEN编码质粒(3μg)或mRNA(1μg)以及3μM其关联寡聚物同源模板转染成纤维细胞。然后，于37℃或30℃温育细胞3天，之后于37℃扩充，直到第10天。通过第3天的Surveyor测定法(第3天Surveyor)测量TALEN活性，并且在第3天和第10天通过RFLP分析测量HDR(第3天％HDR和第10天％HDR)。每个柱形展示来自三个重复的平均值和SEM。图8B是为了评估用寡核苷酸模板进行TALEN诱导的HDR的动力学而产生的实验数据的图。用编码TALEN的mRNA或质粒DNA和靶向LDLR或APC基因的具有4个碱基对插入的寡聚物转染细胞。小图a)在指定时间点时对细胞群体的RFLP分析。小图b)通过密度计量术量化来自小图a的结果，并且平均值在具有SEM(n＝3)的情况中以时间函数绘图。HDR信号在转染后12小时第一次出现，并且随时间积累。图9是为了评估突变类型对HDR频率的影响而产生的实验数据的图。小图a)野生型ssLDR(SEQ ID NO:1)和用于靶向ssLDLR的5种寡聚物的序列：(从上到下：SEQ ID NO:2、3、4、5和6)。在有框的文本中标示TALEN结合位点，并且新的BamHI位点加下划线。对包含BM和插入的SNP画圈。小图b)用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将外源等位基因渐渗入细胞的染色体DNA中的同源性指导修复(HDR)的方法，其包括：将靶向性内切核酸酶系统和包含所述外源等位基因的HDR模板导入所述细胞中，所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合所述染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中所述靶向性核酸酶系统和所述HDR模板运行以将所述染色体DNA改变为与所述HDR模板序列具有同一性，从而将所述外源等位基因渐渗入所述染色体DNA中代替内源等位基因，其中所述靶向内切核酸酶系统和/或HDR模板包含降低该靶向内切核酸酶系统对DNA的特异性结合的特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.27 US 61/870,4011.一种将外源等位基因渐渗入细胞的染色体DNA中的同源性指导修复(HDR)的方法，其包括：将靶向性内切核酸酶系统和包含所述外源等位基因的HDR模板导入所述细胞中，所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合所述染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中所述靶向性核酸酶系统和所述HDR模板运行以将所述染色体DNA改变为与所述HDR模板序列具有同一性，从而将所述外源等位基因渐渗入所述染色体DNA中代替内源等位基因，其中所述靶向内切核酸酶系统和/或HDR模板包含降低该靶向内切核酸酶系统对DNA的特异性结合的特征。2.权利要求1的方法，其中所述降低特异性结合的特征包括相对于所述内源关联序列的所述DNA结合成员序列中的错配和/或相对于所述HDR模板序列的所述DNA结合成员序列中的错配。3.权利要求2的方法，其中所述靶向性内切核酸酶系统包含与核酸酶(TALEN)融合的多个TAL效应器重复序列，其中所述TALEN包含重复可变二残基(RVD)的序列，并且所述错配相对于所述内源关联序列在RVD的序列中。4.权利要求2的方法，其中所述靶向性核酸酶系统包含Cas9核酸酶和引导RNA，其中所述错配相对于所述内源关联序列在gRNA序列中。5.权利要求2的方法，其中所述靶向性内切核酸酶系统包含与核酸酶(TALEN)融合的多个TAL效应器重复序列，其中所述TALEN包含重复可变二残基(RVD)的序列，并且所述错配相对于所述HDR模板序列在RVD的序列中。6.权利要求2的方法，其中所述靶向性核酸酶系统包含Cas9核酸酶和引导RNA，其中所述错配相对于所述HDR模板序列在所述gRNA中。7.权利要求2的方法，其中所述外源等位基因是天然等位基因，并且所述HDR模板包含所述错配，其中所述错配创建不存在于自然界中的序列。8.权利要求2的方法，其中所述外源等位基因没有错配，并且包含由所述细胞表达的DNA。9.权利要求2的方法，其中所述外源等位基因包含所述错配，并且包含由所述细胞表达的DNA。10.权利要求2的方法，其包括选择所述DNA结合成员序列和所述内源关联序列，使得将所述染色体DNA改变为与所述HDR模板序列具有同一性创建相对于改变的染色体DNA序列在所述DNA-结合成员序列中的错配。11.权利要求10的方法，其中所述外源等位基因是天然等位基因，并且所述HDR模板由所述天然等位基因和与所述染色体DNA序列具有同一性的DNA组成。12.权利要求10的方法，其中选择所述DNA结合成员序列和所述内源关联序...

【专利技术属性】
技术研发人员：DF卡尔森，SC法伦克鲁格，
申请(专利权)人：重组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US