本发明专利技术涉及一种监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法及其在鸡种保种上的应用、以及SNP分子标记的鉴定方法。选取若干同类家禽品种，每个家禽品种选取若干个体，按照以下方法筛选SNP：1）所有家禽品种共有，各SNP位点在任一品种中至少存在两个等位基因；2）在基因组上分布相对集中，SNP位点数量在基因组1M 区间内 >90个；3）遗传多样性较为丰富，各SNP位点在任一品种中的最小等位基因频率 >0.1；筛选得到满足上述1）、2）、3）要求的SNP位点。本发明专利技术提供一种利用简化基因组RAD‑seq测序技术对不同地方鸡种进行测序，通过序列比对，鉴定出在不同鸡种基因组上集中分布、遗传多样性较为丰富的一致性SNP位点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法及其在鸡种保种上的应用、以及SNP分子标记的鉴定方法，属于群体遗传学和分子生物学领域。
技术介绍
我国是世界上的鸡品种资源最为丰富的国家之一，现有地方鸡品种资源107个，保护好这些宝贵的遗传资源，对我国家禽产业乃至世界家禽产业可持续发展有重大意义。由于家禽特殊的卵生繁殖方式，活体保种是当前鸡品种资源保存的最主要形式。维持一定的保种群数量，通过采取科学合理的保种方法和继代繁育方式，有效减缓群体近交系数增量，保持其遗传多样性。近二十年来，我国地方鸡品种资源保护取得了显著成就，一是大部分地方鸡品种资源在原产地建有保种场或被国家级鸡种基因库引入保存，二是研究提出了多种适合不同条件的保种技术方法，包括家系等量留种随机选配法、家系等量留种轮回选配法、随机交配法等。然而，这些保种技术方法是基于群体遗传学理论，假定保种群处于理想状态下设定的，其具体效力如何，需要经过保种实践的检验。因此，保种效果监测是鸡保种实施过程中的一项重要内容，依靠科学、可靠的保种效果监测与评价技术，能够及时发现保种实践中出现的各种问题，从而为进一步优化改进保种技术方案提供依据。目前，家禽遗传资源保种效果监测主要依赖于：（1）常规表型性状记录比较分析。主要是选择一些常规易于检测的性状列入监测范围，并不能全面地反映出保种群遗传多样性在保种进程中的真实变化；（2）低密度DNA分子标记检测。发掘DNA分子遗传标记用于遗传多样性检测是近二十年来资源保护领域的研究热点，主要包括扩增片段长度多态性（AFLP）、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）和微卫星多态（SSR）标记。这些分子标记数量非常有限（如普遍采用的适用于鸡遗传多样性分析的微卫星标记仅有约30个，且这些标记并不完全适用于遗传多样性丰富的中国地方鸡种），其所代表的基因组遗传变异信息量严重匮乏，导致监测效力不足。因此，发掘鉴定出适用于我国地方鸡种保种效果监测的高密度DNA分子标记显得尤为重要和迫切。高通量测序技术的发展为鸡遗传多样性保护提供了全新机遇。基于新一代测序技术（NGS），不仅将遗传变异信息的反映提升到单核苷酸多态（SNP）水平，而且能在全基因组水平上高密度地检测出SNP标记。这使得鸡保种效果的全面精细监测成为可能，已经成为目前资源保护领域的一个研究热点。
技术实现思路
本专利技术针对上述缺陷，目的在于提供一种利用简化基因组RAD-seq测序技术对不同地方鸡种进行测序，通过序列比对，鉴定出在不同鸡种基因组上集中分布、遗传多样性较为丰富的一致性SNP位点。为此本专利技术采用的技术方案是：本专利技术选取若干同类家禽品种，每个家禽品种选取若干个体，按照以下方法筛选SNP：1）所有家禽品种共有，各SNP位点在任一品种中至少存在两个等位基因；2）在基因组上分布相对集中，SNP位点数量在基因组1M区间内>90个；3）遗传多样性较为丰富，各SNP位点在任一品种中的最小等位基因频率>0.1；筛选得到满足上述1）、2）、3）要求的SNP位点。1）所有家禽品种共有，各SNP位点在任一品种中至少存在两个等位基因；满足条件1的目的是确保筛选出的位点具有“通用性”，不受品种限制。要求各SNP位点在任一品种中至少存在两个等位基因（即等位基因频率不能为0或1），是确保根据每个SNP位点计算出的杂合度H、多态信息含量PIC不是0或1，若SNP位点的杂合度H、多态信息含量PIC为1或0就失去了保种效果监测的意义。2）在基因组上分布相对集中，SNP位点数量在基因组1M区间内>90个；满足条件2的目的是确保筛选出的染色体片段为“遗传多样性热区”，能更真实地反映出保种群世代传递过程中遗传多样性改变情况，进而反映出保种效果。3）遗传多样性较为丰富，各SNP位点在任一品种中的最小等位基因频率>0.1；满足条件3的目的是确保实际应用中检测到的SNP位点信息真实、可靠，另外，减少不同世代计算结果间差异显著性分析误差。表1基于SNP位点等位基因频率的杂合度和多态信息含量计算注：Pi、Pj为SNP位点第i和j个等位基因的频率。（1）杂合度计算公式。（2）多态信息含量计算公式上述方法应用于鸡品种保种效果监测中。所述鸡品种：选取鹿苑鸡、藏鸡、丝羽乌骨鸡、河南斗鸡、清远麻鸡、安义瓦灰鸡、大骨鸡、边鸡、寿光鸡、东乡绿壳蛋鸡、汶上芦花鸡、崇仁麻鸡、文昌鸡、金湖乌凤鸡、大围山微型鸡、惠阳胡须鸡、仙居鸡、茶花鸡、固始鸡、狼山鸡、瓢鸡、白耳黄鸡、北京油鸡、萧山鸡、琅琊鸡、淮南麻黄鸡、麻城绿壳蛋鸡、如皋黄鸡和隐性白羽肉鸡等29种不同鸡种。每个鸡品种随机选择30个个体。具体分布区间为Chr4：88800000-89800000：SNP位点数量为108个；Chr1：31100000-32100000：SNP位点数量为97个。SNP分子标记的鉴定方法，其特征在于，按照以下步骤进行：1）保种群个体血液采集：使用医用一次性注射器采集保种群随机选留公、母鸡翅静脉全血0.5~1.0ml，采集后迅速注入含有2µL0.5mol/LNa2EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用；2）DNA提取和质量检测：常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2~0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；3）文库构建和简化基因组测序：提取后质检合格的基因组DNA500ng，加入0.6UEcoRI、T4DNA连接酶、ATP和EcoRI接头在37℃下反应3小时，65℃退火1小时，然后加限制性内切酶NlaIII和NlaIII接头在37℃下反应3小时，反应结束后在65℃PCR仪中放置30分钟失活内切酶；使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400-600bp回收酶切产物；使用Qubit3.0对回收产物进行DNA定量，等量混合样品；使用IlluminaTruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建；4）原始序列数据统计和过滤为了保证信息分析质量，对测序得到的原始序列rawreads过滤，得到cleanreads用于后续分析；数据过滤的步骤如下：去除带接头的paired-endreads；当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired-endreads；当单端测序read中含有的低质量碱基数超过该条read长度比例的50%时，需要去除此对paired-endreads；5）序列数据比对和SNP鉴定过滤后得到的cleanreads有效测序数据比对到Gallus_gallus.WASHUC鸡参考基因组，根据比对结果，选取样品平均深度在5以上的group，定义ddRAD标记，进行基于样品的SNP鉴定。本专利技术的优点是：本专利技术通过简化基因组RAD-seq高通量测序技术,鉴定出在不同鸡种基因组上集中分布、遗传多样性较为丰富的一致性SNP位点，能显著提升鸡保种效果监测的科学性和准确性，也为进一步优化改进保种技术方案提供理论依据。本专利技术利用高通量测序技术鉴定出在不同鸡种基因组上集中分布、遗传多样性较为丰富的一致性SNP位点，这些标记位点更适于地方鸡种保种效果监测；根据这些SNP位本文档来自技高网...
【技术保护点】
监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，选取若干同类家禽品种，每个家禽品种选取若干个体，按照以下方法筛选SNP：1）所有家禽品种共有，各SNP位点在任一品种中至少存在两个等位基因；2）在基因组上分布相对集中，SNP位点数量在基因组1M 区间内 >90个；3）遗传多样性较为丰富，各SNP位点在任一品种中的最小等位基因频率 >0.1；筛选得到满足上述1）、2）、3）要求的SNP位点。
【技术特征摘要】
1.监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，选取若干同类家禽品种，每个家禽品种选取若干个体，按照以下方法筛选SNP：1）所有家禽品种共有，各SNP位点在任一品种中至少存在两个等位基因；2）在基因组上分布相对集中，SNP位点数量在基因组1M区间内>90个；3）遗传多样性较为丰富，各SNP位点在任一品种中的最小等位基因频率>0.1；筛选得到满足上述1）、2）、3）要求的SNP位点。2.根据权利要求1所述的监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，应用于鸡品种保种效果监测中。3.根据权利要求1所述的监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，至少选用10个SNP位点进行检测。4.根据权利要求2所述的监测家禽保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，所述鸡品种：选取鹿苑鸡、藏鸡、丝羽乌骨鸡、河南斗鸡、清远麻鸡、安义瓦灰鸡、大骨鸡、边鸡、寿光鸡、东乡绿壳蛋鸡、汶上芦花鸡、崇仁麻鸡、文昌鸡、金湖乌凤鸡、大围山微型鸡、惠阳胡须鸡、仙居鸡、茶花鸡、固始鸡、狼山鸡、瓢鸡、白耳黄鸡、北京油鸡、萧山鸡、琅琊鸡、淮南麻黄鸡、麻城绿壳蛋鸡、如皋黄鸡和隐性白羽肉鸡等29种不同鸡种。5.根据权利要求4所述的监测鸡保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，每个鸡品种随机选择30个个体。6.根据权利要求4或5所述的监测鸡保种效果的高密度SNP分子标记筛选方法，其特征在于，具体分布区间为Chr4：88800000-89800000：SNP位点数量为108个；Chr1：31100000-32100000：SNP位点数量为97个。7.如上述任一权利要求所述的SNP分子标记的鉴定方法，其特征在于，按照以下步骤进行：1）保种群个体血液采集：使用医用一次性注射...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩威，苏一军，李国辉，王洪志，朱云芬，盛中伟，张会永，殷建玫，邹剑敏，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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