用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法技术

公开了用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的系统和方法，其中所述受试者的细胞(例如上皮)附着于基片的尖端。将基片的尖端在裂解溶液中搅动，所述裂解溶液裂解附着于基片的细胞。当该搅动完成时从裂解溶液移出基片。温育所得裂解溶液，然后从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液。从这之中，使用至少两个寡核苷酸引物对和gDNA溶液鉴定出人TGFpI基因中存在的至少两个核苷酸的身份。这至少两个核苷酸位于TGFpI基因的分别的独立位置，其对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本申请一般涉及用于分离和检测疾病有关的遗传等位基因的方法。具体地，本申请涉及用于检测Avellino角膜营养不良有关的等位基因的改进的方法。专利技术背景实时PCR可用于检测具有基本相同序列的核酸序列之间的差异。通过使用差异标记的荧光核酸探针(例如一种结合野生型序列而一种结合突变体序列)，能快速并可靠地检测人基因组中的单核苷酸变化。这种解析能力已被应用于医学诊断，其中单核苷酸多态性(SNP)，即在蛋白质的编码和/或非编码序列中发现的单碱基变化，与人疾病相关。然而，实时PCR分析高度依赖于高质量样品的收集和分离。不良样品收集和/或分离需要使用更长的测定条件和更大量的实时PCR试剂，两者都导致增加的成本和降低的生产力。此外，实时PCR单核苷酸多态性检测测定的失败可引起对收集额外的样品的需要，从而导致甚至更大的时间和资源损失。因此，高度期望产生改进的样品收集和分离的方法，其改进测定的总体成功率，减少测定所需的试剂，且减少在后期收集额外样品的需要。此外，用于以较低样品材料量实施实时PCR SNP检测测定的方法还将降低与高质量样品的收集和分离有关的挑战。角膜营养不良可以是常染色体显性的遗传疾病，其开始在患者的角膜中间具有模糊的视力。此模糊视力逐渐蔓延至角膜周边，且视力随着患者年龄增加而恶化。有几种类型的已表征过的角膜营养不良，包括阿维利诺(Avellino)角膜营养不良、颗粒状(Granular)角膜营养不良、格子状I型(lattice type I)角膜营养不良、Thiel-Behnke、和Reis-bucklers角膜营养不良。已知角膜营养不良至少在一些情况中是由编码βIG-H3蛋白(也称为TGFβI蛋白，TGFBI蛋白和角膜上皮蛋白)的转化生长因子beta诱导(TGFβI)基因中的突变引起的。患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者随着年龄具有增加的视力丧失，在生命的晚年变得严重。比较而言，纯合患者到6岁龄呈现出严重到完全的视力丧失。阿维利诺角膜营养不良首先在约1988年被认可为一种独特的角膜营养不良类型。在那时之前，其可能被错误分类为颗粒状角膜营养不良。现今，已知阿维利诺角膜营养不良是世界范围内最常见的间质角膜营养不良形式。在韩国，据信阿维利诺角膜营养不良具有870个人中约1的流行率(参见Lee,J.H.等,Ophthalmic Epidemiol.,17:160,2010；亦参见Holland,E.J.等,Ophthalmology,99:1564,1992；Kennedy,S.M.等,Br.J.Ophthalmol.,80:489,1996；Dolmetsch,A.M.等,Can.J.Ophthalmol.,31:29,1996；Afshari,N.A.等,Arch.Ophthalmol.,119:16,2001；Stewart,H.S.Hum.Mutat.,14:126,1999)。之前发现杂合个体(例如，具有一个野生型βIG-H3等位基因和一个突变体βIG-H3等位基因)在LASIK手术后高度易于视力丧失加剧。特别地，手术后两年时，在具有增加的攻击性的这些患者中观察到增加的角膜不透明性，最终导致视力的完全丧失(Jun,R.M.等,Opthalmology,111:463,2004)。之前，进行眼手术，预期通过LASIK或Excimer激光手术将使患有角膜营养不良的患者摆脱视力模糊。假定有30万例LASIK手术，则300个人会失去其视力，基于患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者为1/1000的最小估测。经历LASIK手术的患者主要在其进行生产活动的20多岁及30多岁中；因此，他们的视力丧失导致严重的社会和经济问题。另外，美国2000年批准LASIK手术后，已发现经历LASIK手术的患有阿维利诺角膜营养不良的非洲裔美国患者丧失视力，其推断许多相似的病例可发生在世界各地。因此，尽管为了预防由LASIK手术所致的阿维利诺角膜营养不良的进展需要对阿维利诺角膜营养不良的准确诊断，但仅通过对角膜不透明度的显微观察(例如裂隙灯(slitlamp)检查)进行对阿维利诺角膜营养不良的诊断，因而医生经常遗漏患者的潜在症状，从而进行LASIK手术，这导致视力丧失。因此，期望快速并准确地对角膜营养不良进行遗传诊断。已开发了用于检测βIG-H3基因突变的DNA芯片，该突变造成阿维利诺角膜营养不良(韩国专利早期公开号10-2007-0076532)。然而，使用DNA芯片诊断阿维利诺角膜营养不良不利地需要几个步骤，包括扩增样品中DNA的步骤，使扩增的DNA与DNA芯片杂交的步骤，洗涤杂交的DNA芯片的步骤，和检测阳性应答的步骤。鉴于上述背景，本领域中需要用于检测与角膜营养不良有关的多重突变等位基因的改进的方法。专利技术概述本公开提供用于检测与人疾病有关的一种或多种等位基因的改进方法。下文描述的方法降低实施得到关于受试者的医学信息的测定法相关的时间和成本。例如，在一些实施方案中，所述改进的方法允许以对患者的降低的成本，同日检测与阿维利诺角膜营养不良有关的基因组标志物。在一些实施方案中，本公开提供用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的方法，所述方法包括：(A)提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；(C)在完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片；(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；(E)从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和(F)使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA溶液确定TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFβI基因的分别的独立的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，所述TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸在人基因组中相隔至少一个核苷酸。在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对包含第一扩增引物对和第二扩增引物对。所述第一扩增引物对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。所述第二扩增引物对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。在一些实施方案中，(F)确定进一步包括使用：(i)具有包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列的第一野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49的核苷酸序列的第一突变体检测探针；和(ii)具有包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的第二野生型检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的方法，所述方法包括：(A)提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；(C)在完成(B)搅动时，从所述裂解溶液移出该基片；(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；(E)从所述裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和(F)使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA溶液确定TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFβI基因的分别的独立的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.15 US 61/905,0511.用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的方法，所述方法包括：(A)提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；(C)在完成(B)搅动时，从所述裂解溶液移出该基片；(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；(E)从所述裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和(F)使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA溶液确定TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFβI基因的分别的独立的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。2.根据权利要求1的方法，其中所述TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸在人基因组中相隔至少一个核苷酸。3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对包含第一扩增引物对和第二扩增引物对，其中:所述第一扩增引物对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQID NO:1的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；和所述第二扩增引物对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQID NO:43的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述(F)确定进一步包括使用：(i)具有包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列的第一野生型检测探针，和具有包含SEQ IDNO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49的核苷酸序列的第一突变体检测探针；和(ii)具有包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的第二野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列的第二突变体检测探针。7.用于检测角膜营养不良的方法，包括：(A)使用包含至少第一扩增引物对和至少第二扩增引物对的反应混合物从来自人受试者的生物样品扩增至少两种TGFβI基因序列，包括第一TGFβI基因序列和第二TGFβI基因序列，所述第一TGFβI基因序列包含编码氨基酸残基124的核苷酸，所述第二TGFβI基因序列包含编码氨基酸残基555的核苷酸；(B)将第一检测寡核苷酸探针对的第一检测探针杂交至所述第一TGFβI基因序列；(C)将第二检测寡核苷酸探针对的第二检测探针杂交至所述第二TGFβI基因序列；和(D)基于至少两种检测探针对的使用检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的一个或多个突变，所述至少两种检测探针对包括第一检测寡核苷酸探针对和第二检测寡核苷酸探针对。8.根据权利要求7的方法，其中检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的一个或多个突变包括检测所述第一TGFβI基因序列和/或所述第二TGFβI基因序列中的两个或更多个突变，且所述两个或更多个突变在人基因组中相隔至少一个核苷酸。9.根据权利要求7或8的方法，其中所述至少第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，其中所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1且其中所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。10.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所述至少第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，其中所述第三扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:43所示且其中所述第四扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:44所示。11.根据权利要求7或8的方法，其中：所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，和所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。12.根据权利要求7-11中任一项的方法，其中所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。13.根据权利要求7-12中任一项的方法，其中所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。14.根据权利要求7-13中任一项的方法，其中所述至少两种检测寡核苷酸探针对的每种各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID NOs:25-26，SEQ ID NOs:25和48，SEQ ID NOs:25和49，SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQID NOs:31-32，SEQ ID NOs:33-34，SEQ ID NOs:35-36，SEQ ID NOs:37-38，SEQ ID NOs:39-40，SEQ ID NOs:41-42，SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47，SEQ ID NOs:45和50，和SEQ ID NOs:47和50。15.根据权利要求7-14中任一项的方法，其中所述第一检测寡核苷酸探针对包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。16.根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。17.根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。18.根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。19.根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。20.根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。21.根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。22.根据权利要求7-21中任一项的方法，其中所述第一检测探针与第一标记物偶联且所述第二检测探针与第二标记物偶联。23.根据权利要求22的方法，其中所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。24.权利要求7的方法，其中(B)杂交和(C)杂交在相同溶液中同时实施。25.权利要求7的方法，其中所述(B)杂交和(C)杂交在相同溶液或不同溶液中同时或在不同时间实施。26.用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含：(A)至少第一扩增引物对和第二扩增引物对，其用于扩增和确定(1)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFβI基因序列的第一TGFβI基因序列，其包含编码氨基酸残基124的核苷酸，和(2)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFβI基因序列的第二TGFβI基因序列，其包含编码氨基酸残基555的核苷酸；和(B)至少两种检测探针对，其中所述至少两种检测探针对的每种中的检测探针与所述至少两种TGFβI基因序列的至少一种杂交。27.根据权利要求26的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。28.根据权利要求26或27的反应混合物，其中所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。29.根据权利要求26-28中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变：在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。30.根据权利要求26-29中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变：在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。31.根据权利要求26-30中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的分别的检测探针对各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ IDNOs:25-26，SEQ ID NOs:25和48，SEQ ID NOs:25和49，SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ ID NOs:31-32，SEQ ID NOs:33-34，SEQ ID NOs:35-36，SEQ ID NOs:37-38，SEQ IDNOs:39-40，SEQ ID NOs:41-42，SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47，SEQ ID NOs:45和50，和SEQ ID NOs:47和50。32.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：C查奥谢恩，S乔，G李，
申请(专利权)人：阿维利诺美国实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US