本发明专利技术提供一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗肿瘤中的应用，根据肿瘤的基因-放射治疗理论及Egr-1基因的辐射诱导表达特性，在克隆小鼠B7.2基因的基础上，构建了双基因共表达质粒pEgr-IL18-B7.2。通过双基因载体，把有抗肿瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因转染肿瘤细胞，本发明专利技术进一步证明了低剂量辐射可以诱导辐射敏感启动子从而对多基因表达起更精细调控的作用；辐射诱导双基因的表达呈现一定的时程和量效规律。本实验还把构建的双基因质粒注射于小鼠移植的B16黑色素瘤的瘤体，配合局部放射治疗，表现了比单纯放疗更加显著的抑瘤效果。并对可能的免疫学方面机理做了初步探讨。
【技术实现步骤摘要】
[00011本专利技术涉及肿瘤基因治疗
，具体涉及一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达 质粒的构建及联合辐射抗肿瘤应用。
技术介绍
恶性肿瘤在当代是威胁人类健康的主要原因之一。目前，放射治疗仍然是临床治 疗肿瘤的主要方法之一。放射治疗随着放射物理学及放射生物学的不断发展，几十年来其 疗效已经取得到巨大提高。但放疗仍然存在其自身的缺点和困难，例如，放疗后肿瘤的复发 和转移，放疗对自身正常组织的损伤等，对肿瘤患者的生存造成威胁。恶性肿瘤发生发展机 制十分复杂，是一个多因素、多环节、多阶段及多基因的复杂疾病，单一疗法疗效往往欠佳， 因此肿瘤综合治疗仍然是当今肿瘤防治研究的热点。近年来随着分子生物学研究的迅速发 展及"人类基因组计划"的实施，基因治疗越来越受到人们的极大关注。特别是基因疗法和 放射治疗联合治疗给肿瘤患者重生带来希望。肿瘤的基因-放射治疗(gene-radiotherapy)是近年来兴起的、有效解决放射治疗 和基因治疗各自的难点和薄弱环节的综合治疗肿瘤的新方法。基因-放射治疗理论的确立 为肿瘤放射治疗和基因治疗的结合开辟了新途径。特别是随着功能基因组学的发展、有效 治疗基因的筛查和表达调控的进一步研究，为肿瘤基因放射治疗的探索提供了科学的研究 方向。 美国哈佛大学和芝加哥大学的研究者最早进行了肿瘤基因治疗联合放射治疗的 实验研究，将治疗基因克隆于可被辐射诱导激活的Egr-Ι启动子下游，通过转染，将具辐射 诱导表达特性的治疗基因转入瘤体内，在对肿瘤实施局部放疗时诱导肿瘤杀伤基因的表 达，形成射线和基因对肿瘤的双重杀伤作用。一方面可以相对降低有效照射剂量，缓解正常 组织的损伤；另一方面通过射线的局部照射来实现肿瘤杀伤基因的定位表达，对治疗基因 的表达进行时空调控。以往的实验结果表明，下游治疗基因的选择对实现这一治疗方案，提 高基因-放射治疗效果至关重要。 共刺激分子B7是参与T细胞活化的重要粘附分子，表达于大部分抗原递呈细胞表 面，与T细胞表面的CD28相互作用使IL-2等淋巴因子的mRNA转录增强，为激发T细胞免疫反 应提供第二信号，大多数肿瘤细胞不表达B7分子，因而逃避了免疫细胞的监视。IL-18又称 干扰素γ诱生因子(IGIF)，具有抗感染、抗肿瘤、抗超敏反应等作用。目前IL-18在肿瘤治疗 中的意义的研究已成为新的热点，认为IL-18通过细胞毒作用、参与粘附分子调节、抑制肿 瘤血管生成等多种途径发挥其抗肿瘤作用。实践表明，单一一种基因治疗作用较弱。
技术实现思路
(一)解决的技术问题 针对现有技术的不足，本专利技术提供一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建 及其在联合辐射抗肿瘤中的应用，本专利技术构建了双基因共表达质粒pEgr-IL18-B7.2,通过 双基因载体，把有抗肿瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因转染肿瘤细胞，在分子水 平检测IL18及B7.2表达显著增高，表现了比单纯放疗更加显著的抑瘤效果，还可明显提高 免疫力，机体抑瘤能力显著增高。 (二)技术方案 为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现： 一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒的构建，包括以下步骤： S1、取PIRES载体，用Xbal及Smal酶切，另取连接B7-2基因的T载体，用PstI酶切，得 到pIRES载体和B7-2基因片断，粘端补平，然后把B7-2基因连接到pIRES上，得到第一中间 质粒PIRES-B7-2; S2、分别用BamHI和Xbal酶切pIRES-B7-2质粒和KS-IL18质粒，补平粘端，再用 EcoR頂每切，得到pIRES-B7-2和IL18片断，把IL18基因连接到pIRES-B7-2上，得到第二中间 质粒PIRES-IL18-B7-2; S3、用SacI酶切质粒pIRES-IL18-B7-2,补平，电泳回收，得到IL18-B7-2大片断，用 EcoRV酶切质粒pcDNA3·l-Egr-Ι，去磷，把大片段IL18-B7-2连接到pcDNA3·l-Egr-Ι上，得到 双基因表达质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2,即可。 优选的，所述mIL-18和mB7-2基因分别定向克隆至IRES前后插入位点，从而使mlL-18和mB7-2基因在同一载体上获得良好相关表达。pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒 在联合辐射抗肿瘤中的应用，将所述重组质粒体外转染B16黑色素瘤细胞，经0.1~6.OGy剂 量的X射线照射后体外激活Egr-Ι启动子诱导mIL-18和B7-2表达。优选的，所述X射线照射剂量为0.5~5.OGy。 优选的，所述pEgr-IL18-B7.2双基因能够提高机体免疫活性，增强NK和CTL细胞毒 效应，刺激T细胞和腹腔巨噬细胞分泌IFN-γ和TNF-α，肿瘤局部B7-2的表达增强免疫细胞 对肿瘤细胞的识别杀伤能力。(三)有益效果本专利技术提供了一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗 肿瘤中的应用，本专利技术以多基因表达载体为基因导入系统，把有抗肿瘤作用的IL18基因及 共刺激分子B7-2基因转染肿瘤细胞，通过辐射诱导使之表达IL18及B7.2分子，增强肿瘤的 免疫原性，提高机体抗肿瘤的免疫功能;通过基因-放射治疗不仅实现了放疗、免疫及基因 治疗的协同作用，而且达到了对基因表达的时空调控的目的；本专利技术可为恶性肿瘤患者提 供一个特异、靶向性的多基因联合治疗模式，并为临床应用奠定理论和实验基础。【附图说明】 图1为RT-PCR扩增小鼠mB7-2的cDNA，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到的930bp 片段图； 图2为质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2的酶切鉴定图；图3为质粒pcDNA3 · l-Egr-B7-2的鉴定图；图 4 为质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2 的鉴定图；图5为不同剂量X射线照射8h后重组质粒转染的B16细胞表面B7.2蛋白表达变化 图；图6为不同剂量X射线照射8h后重组质粒转染的B16细胞上清中IL18表达变化图；图7为5Gy剂量X线照射C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治 疗抑瘤作用图；图8为C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗后脾CTL细胞 毒性活性的变化图；图9为C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗后脾NK细胞毒 性活性的变化。【具体实施方式】为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例 及附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本 专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在 没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一、材料与方法 1、主要试剂及器材 1.1试剂 3、质粒与菌种双基因共表达质粒pIRESlneo购自BD公司，pMD18-T、pcDNA3.l( + )、pGL3-Egrl-EnhancerVector、pEgr_l由田梅博士惠赠，pBlueminusKS(-)_IL18由金光辉博士惠赠，感 受态大肠杆菌DH5a本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种pEgr‑IL18‑B7.2双基因共表达重组质粒的构建，其特征在于，包括以下步骤：S1、取PIRES载体，用XbaI及SmaI酶切，另取连接B7‑2基因的T载体，用PstI酶切，得到pIRES载体和B7‑2基因片断，粘端补平，然后把B7‑2基因连接到pIRES上，得到第一中间质粒pIRES‑B7‑2；S2、分别用BamHI和XbaI酶切pIRES‑B7‑2质粒和KS‑IL18质粒，补平粘端，再用EcoRI酶切，得到pIRES‑B7‑2和IL18片断，把IL18基因连接到pIRES‑B7‑2上，得到第二中间质粒pIRES‑IL18‑B7‑2；S3、用SacI酶切质粒pIRES‑IL18‑B7‑2，补平，电泳回收，得到IL18‑B7‑2大片断，用EcoRV酶切质粒pcDNA3.1‑Egr‑1，去磷，把大片段IL18‑B7‑2连接到pcDNA3.1‑Egr‑1上，得到双基因表达质粒pcDNA3.1‑Egr‑IL18‑B7‑2，即可。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨建征，郭杰，王铁君，于雷，边丽，闫文星，任晓俊，宋新灵，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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