一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属法医学技术领域，具体涉及一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液、单碱基延伸反应混合液构成。本发明专利技术还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括提取样品核酸、配置反应体系进行扩增、电泳分析步骤。本发明专利技术通过单管内的复合扩增反应和多重单碱基延伸反应，利用通用的毛细管电泳平台，可一次性快速、准确地获得生物检材的20个三等位基因SNP遗传标记的分型，确定检材的个体来源，为法医个人识别提供一种新的技术手段。该试剂盒在法医学领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于法医遗传学领域，具体涉及一种用于法医个体识别的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。
技术介绍
单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)作为第三代遗传标记，具有含量丰富、遗传稳定、突变率低的特点，在法医学中有特殊的应用价值。目前有若干种二等位基因SNP的法医试剂盒已经市场化并应用于法医个人识别或亲子鉴定，大量的实验和实际应用结果显示二等位基因SNP的法医试剂盒可以解决很多法医学实际问题。但是，二等位基因的SNP有其局限性，比如信息量与具有较多等位基因的STR遗传标记差距较大，至少需要50－60个SNP位点才能达到13－15个常用STR的累计个人识别率和非父排除率。而大量二等位基因SNP的复合扩增，不仅增加了检测成本，且大大增加了复合检测和数据分析的难度。二等位基因SNP的另一个局限性在于无法用于混合样本的分析。混合样本，尤其是混合血痕，是暴力犯罪和意外事故中常见的生物性检材。二等位基因SNP无法提示混合样本中多个来源个体的存在，因而对混合样本的分析无能为力。三等位基因单核苷酸多态性(Tri－allelicSingleNucleotidePolymorphism，Tri－allelicSNP)是指在一个群体中基因的特定核苷酸位置上出现三种碱基，其中最少的一种在群体中的频率大于1％。理论上，三等位基因SNP具有低突变率、只需扩增很短DNA片段就可以包含SNP位点等特点，而且由于等位基因数量增加，因此可以用比二等位基因SNP少的位点数就可获得和现有STR系统大致相同的个人识别率和非父排除率。然而，目前有关三等位基因SNP在法医物证领域的研究还属于起步阶段。2004年，Phillips等首次提出了三等位基因SNP在法医物证领域应用的可能性，并在欧洲和非洲人群中发现了9个三等位基因SNP。而Westen等在2009年通过在荷兰人和欧美混血人群中共发现了11个具有三等位基因的SNP，并证实它们可以有效地分型降解样本。Antoinette等同时采用DNA修饰酶法﹑miniSTR系统和三等位基因SNP系统对降解样本进行分型，结果显示三等位基因SNP非常适合鉴定降解样本。目前为止，可以应用于法医学个人识别的三等位基因SNP数量有限，尚无法构建可以与现有STR系统媲美的高识别能力的体系。如何从庞大的SNP数据库中筛选到一组三等位基因SNP，构建一种基于现有法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台进行分析检测的试剂盒，可对痕量、降解检材的DNA进行个人识别、能对混合检材进行分析，以达到确定检材个体来源的目的，已经成为法医遗传界有待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是实现利用三等位基因SNP遗传标记对未知来源的人类生物学检材进行法医学个人识别，从而能确定所述样本的个体来源。本专利技术解决该技术问题的方案是提供一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。该基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液、扩增产物纯化试剂组成。本专利技术试剂盒中的复合扩增反应混合液、单碱基延伸反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品，优选的，为商业化产品。其中所述的复合扩增反应混合液含有PCR缓冲溶液、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶；所述的扩增产物纯化试剂含有核酸外切酶1及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液；所述的单碱基延伸反应混合液含有DNA聚合酶、缓冲液、氯化镁、荧光标记双脱氧核糖核酸。本专利技术提供的复合扩增引物混合物含40条引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.40所示：表1单管内复合扩增引物对所述复合扩增引物混合物能在单管内对含有20个三等位基因SNP遗传标记的所有DNA片段一次性同时扩增。本专利技术中的多重单碱基延伸引物混合物能利用上述复合扩增引物混合物的扩增产物为模板，在单管内进行20个三等位基因SNP遗传标记的多重单碱基延伸反应。多重单碱基延伸反应引物混合物包含20个三等位基因SNP遗传标记的共计20条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸反应引物的核苷酸序列为下表2中SEQIDNo.41至SEQIDNo.60所示。表2单碱基延伸反应引物序列所述多重单碱基延伸引物前端“－”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示某一个脱氧核糖核苷酸的重复数。本专利技术中的等位基因分型标准物混合物由20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成；各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的三个等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物；所述的等位基因分型标准物混合物包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因；所述60个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的RS号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如表3所示：表320个三等位基因SNP的等位基因分型标准物核苷酸序列及所加荧光标记所述各序列中“－”符号前为加尾序列；阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复数。本专利技术还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括：提取样品核酸、配置反应体系进行扩增、结果判读等步骤，具体为：A、提取待检测样本的DNA，作为扩增模板，所述的提取样本DNA方法为常用的通用方法，优选为Chelex－100法；B、利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行单管内复合扩增；所述的复合扩增反应体系为20μL，其中复合扩增引物混合物4μL、复合扩增反应混合液10μL、10ng/μL的DNA模版1μL去离子水补齐到20μL；所述复合扩增PCR的反应得循环参数为：94℃，5分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；然后72℃，10分钟；C、纯化步骤B所得的复合扩增产物，并以它为模版，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行单管内多重单碱基延伸反应；所述的纯化步骤为取4μL复合扩增PCR产物，加入10IU的核酸外切酶1，2IU的虾碱性磷酸酶，1μL的10倍浓度虾碱性磷酸酶缓冲液、1μL的10倍浓度核酸外切酶缓冲液，用去离子水补充到10μL，混匀后进行纯化反应，反应程序为37℃，80分钟，85℃，15分钟，...

【技术保护点】
一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液及扩增产物纯化试剂；所述的复合扩增反应混合液含有PCR缓冲溶液、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶；所述的扩增产物纯化试剂含有核酸外切酶1及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液；所述的单碱基延伸反应混合液含有DNA聚合酶、缓冲液、氯化镁、荧光标记双脱氧核糖核酸；其特征在于：所述的复合扩增引物混合物包含了20个三等位基因SNP遗传标记的共计40条扩增引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.40所示：所述多重单碱基延伸反应引物混合物含有20个三等位基因SNP遗传标记的单碱基延伸引物，其核苷酸序列为下表中SEQ ID No.41至SEQ ID No.60所示：序号SNP基因座的RS号各多重单碱基延伸引物序列序列表中的序号1RS2236296CCCAGCATTGGCTGGCSEQ ID No.412RS1150911CCCAGGATATAGCGCAGTTCSEQ ID No.423RS3780889TTACATTAGCATGCACTGAAGGAAASEQ ID No.434RS128009812C－ATGGCAATCACCCCACCTSEQ ID No.445 RS38241688C－GTTTCAATAGCGCTGTGGTGTCSEQ ID No.456RS201221419C－GAGTAATCAGACACTCCCCCSEQ ID No.46 7RS1395824C－CCGCAGCACACACAGTGAGASEQ ID No.47 8RS203123726C－ATTCTTGGCCTGTCTGTTCCTSEQ ID No.48 9RS225387228C－CCGGTCATGTAGGAGAGAAGCTCSEQ ID No.49 10RS207573134C－TCGCTCTCGTCTTGGGTTTAASEQ ID No.50 11RS380173237C－CCTAGCCAAAGAAGCAGGCTTASEQ ID No.5112RS229198240C－CATGGGCTGGGTTAATCTGATTGSEQ ID No.5213RS312071541C－CCGTGTTTCAGGATCAAACTTAGAGSEQ ID No.5314RS152787547C－TTCATCGATTCCAGAGTCTTTTCCTSEQ ID No.5415RS207289950C－TCCTTGGAAAGTTAGAGTCTCTGAGSEQ ID No.5516RS376133460C－CCCCCAGCGTAGCCAAAGTTASEQ ID No.5617RS462698 58C－AGAAAGGAAGAGTTAGTAGCTTGTGSEQ ID No.5718RS229223463C－TTTGGTTTCTGCAGCAGCAAATCSEQ ID No.5819RS42371060T－CCCCCCCCCCCCACACGAGGGGAAACASEQ ID No.59 20RS207107169T－CCCGGTCCTAGGGCTGAAGGSEQ ID No.60所述各序列中“－”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复数；所述的等位基因分型标准物混合物由20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因；所述60个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的RS号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如下表所示：所述各序列中“－”符号前为加尾序列；阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复次数。...

【技术特征摘要】
1.一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括由分离包
装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、
复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液及扩增产物纯化试剂；所述的复合扩增反应
混合液含有PCR缓冲溶液、氯化镁、dNTPs、DNA聚合酶；所述的扩增产物纯化试剂含有核
酸外切酶1及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液；所述的单碱基延伸反应混合液含
有DNA聚合酶、缓冲液、氯化镁、荧光标记双脱氧核糖核酸；其特征在于：所述的复合扩
增引物混合物包含了20个三等位基因SNP遗传标记的共计40条扩增引物，各条引物的核
苷酸序列分别为下表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.40所示：
所述多重单碱基延伸反应引物混合物含有20个三等位基因SNP遗传标记的单碱基延
伸引物，其核苷酸序列为下表中SEQIDNo.41至SEQIDNo.60所示：
序号
SNP基因座的RS号
各多重单碱基延伸引物序列
序列表中的序号
1
RS2236296
CCCAGCATTGGCTGGC
SEQIDNo.41
2
RS1150911
CCCAGGATATAGCGCAGTTC
SEQIDNo.42
3
RS3780889
TTACATTAGCATGCACTGAAGGAAA
SEQIDNo.43
4
RS1280098
12C－ATGGCAATCACCCCACCT
SEQIDNo.44
5
RS3824168
8C－GTTTCAATAGCGCTGTGGTGTC
SEQIDNo.45
6
RS2012214
19C－GAGTAATCAGACACTCCCCC
SEQIDNo.46
7
RS13958
24C－CCGCAGCACACACAGTGAGA
SEQIDNo.47
8
RS2031237
26C－ATTCTTGGCCTGTCTGTTCCT
SEQIDNo.48
9
RS2253872
28C－CCGGTCATGTAGGAGAGAAGCTC
SEQIDNo.49
10
RS2075731
34C－TCGCTCTCGTCTTGGGTTTAA
SEQIDNo.50
11
RS3801732
37C－CCTAGCCAAAGAAGCAGGCTTA
SEQIDNo.51
12
RS2291982
40C－CATGGGCTGGGTTAATCTGATTG
SEQIDNo.52
13
RS3120715
41C－CCGTGTTTCAGGATCAAACTTAGAG
SEQIDNo.53
14
RS1527875
47C－TTCATCGATTCCAGAGTCTTTTCCT
SEQIDNo.54
15
RS2072899
50C－TCCTTGGAAAGTTAGAGTCTCTGAG
SEQIDNo.55
16
RS3761334
60C－CCCCCAGCGTAGCCAAAGTTA
SEQIDNo.56
17
RS462698
58C－AGAAAGGAAGAGTTAGTAGCTTGTG
SEQIDNo.57
18
RS2292234
63C－TTTGGTTTCTGCAGCAGCAAATC
SEQIDNo.58
19
RS423710
60T－CCCCCCCCCCCCACACGAGGGGAAACA
SEQIDNo.59
20

【专利技术属性】
技术研发人员：扎拉嘎白乙拉，廖慧丹，蔡继峰，刘颖，刘艳芳，郭亚东，闫杰，丁艳君，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43