一种生物素化荧光素酶的表达方法技术

本发明专利技术提供一种生物素化荧光素酶的表达方法，其中：使用一种由14个氨基酸残基组成的生物素受体肽GLNDIFEAQKIEWH，将其编码基因与荧光素酶编码基因在大肠杆菌宿主细胞内融合表达，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。与利用BCCP87进行生物素化修饰技术相比，本发明专利技术提供的表达方法使得生物素化荧光素酶的产量提高了47％以上；催化活力提高了10倍以上。按照本发明专利技术提供的表达方法表达的生物化荧光素酶被磁珠固定后得到的Bead-LUC在反复洗涤10次和15次后，仍能够维持相较于洗涤前93％以上和90％以上的相对活力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种生物素化DNA聚合酶的表达方法。
技术介绍
萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.5～7)是一种氧化还原酶类。萤火虫荧光素酶在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、O2以及Mg2+的参与下，能够催化D-荧光素氧化脱羧，并将化学能转化为光能，同时释放黄绿色荧光。具体反应过程及发光机制如下：萤火虫荧光素酶先将荧光素和Mg-ATP复合物转化为相应的过渡态产物虫荧光素腺苷酸；过渡态产物迅速与O2反应，释放出腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)后，形成激发态产物氧化荧光素；激发态产物释放光量子回到基态。其中最典型的为北美萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.7)。北美萤火虫荧光素酶由单一多肽链组成，含有511个氨基酸残基，相对分子量约为62KD，不含辅因子并且大部分氨基酸为非极性氨基酸。萤火虫荧光素酶在许多领域存在重要应用性。例如用于病原微生物的快速检测：当催化体系中的荧光素和其他成分过量时，催化发光的强度与ATP的量成正比，另一方面研究人员发现细菌中ATP的含量固定，因此可通过利用荧光素酶测定样品中的ATP含量来间接估测样品中细菌的数量。该方法被广泛应用于临床医学以及法医学检测、环境监测、生命科学研究等领域。此外，荧光素酶基因还能够作为报告基因用于检测目的基因的表达情况：利用荧光素酶基因与目的基因的平行表达，能够显示目的基因在什么时间、部位以及诱因下进行表达。荧光素酶的另一个重要应用是用于核酸序列的测序<br>分析：荧光素酶、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸双磷酸酶四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应构成了焦磷酸测序技术的核心。焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是新一代的利用生物发光反应进行序列测定的技术，DNA聚合酶是其关键用酶之一，它是由DNA聚合酶(polymerase)、ATP硫酸化酶、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)四种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和上述4种酶构成，反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)和荧光素(luciferin)。在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3’末端，同时释放出一分子的PPi；在ATPS的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成等量的ATP；生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。近年来出现了一种高通量光导纤维皮升级微反应池阵列焦测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，这极大地推动了后基因组计划的发展。然而，这种高通量焦磷酸测序技术需要将荧光素酶等核心酶固定在微球表面。实现固定化的常用手段是将荧光素酶经过生物素标记后，通过与微球表面的链亲和素反应，从而被固定在微球表面。常用的蛋白质生物素化修饰的方式主要有化学法和生物法两种，化学修饰法主要通过化学反应将生物素连接到蛋白质中赖氨酸残基游离氨基上。酶作为一种生物活性物质，对温度、pH值、金属离子以及有机试剂等非常敏感。而在化学修饰过程中常常引入大量有机试剂等因素，可能对酶的催化活性产生影响，引起酶活力降低甚至丧失。此外，化学修饰法存在操作繁琐、产物不均一的缺点。在化学修饰的过程中，如果处于蛋白质活性中心的赖氨酸残基被修饰，也很可能影响到蛋白质的活性，是酶活降低甚至失活。生物修饰法制备生物素化是通过将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白(biotincarboxylcarrierprotein)的C端87个氨基酸(BCCP87)作为生物素受体，与ATPS构建到同一表达载体上，并进行融合表达，在大肠杆菌生物素合成酶(biotinholoenzymesynthetase,BirA)的催化下，使融合表达的ATPS连上生物素。例如，有研究报道采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶(LUC)在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行融合表达，以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP87-LUC)，表达的生物素化荧光素酶能够被磁珠(Bead)固定形成Bead-LUC且用于焦磷酸测序，形成的Bead-LUC经过3次洗涤后想回残留活性为95.2％，经过6和9次洗涤后相对残留活性分别为90.1％和83.4％(朱术会，邹秉杰，武海萍，马寅姣，陈颖，周国华.热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用[J].分析化学，2010，04：458-463.)。生物修饰法虽然可以避免化学修饰法的缺点，但利用BCCP87和ATPS构建的重组表达载体在进行融合表达时，由于需要多表达87个氨基酸残基，一定程度降低了融合蛋白的表达量；并且存在部分包涵体表达的重组蛋白；表达出的融合蛋白ATPS活性相对较低。因此，无法更好地满足实际应用。综上所述，提供一种更加高效的生物素化荧光素酶的表达方法，一方面使得表达的生物素化荧光素酶的产量与活性均大幅提高；另一方面提高表达的生物素化荧光素酶被磁珠固定后的洗涤耐受性，是其在焦磷酸测序技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。本专利技术要解决的问题是提供一种生物素化荧光素酶的表达方法，实现荧光素酶在宿主细胞内的生物素化修饰，一方面使得表达的生物素化荧光素酶的产量与活性均大幅提高；另一方面提高表达的生物素化荧光素酶被磁珠固定后的洗涤耐受性，提高其在焦磷酸测序技术中的实用性。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种生物素化荧光素酶的表达方法，其中：使用一种由14个氨基酸残基组成的生物素受体肽，将该生物素受体肽的编码基因通过一对特异性引物与PCR技术扩增到荧光素酶编码基因的上游，获得该生物素受体肽和荧光素酶的融合编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物素化荧光素酶的表达方法，其特征在于：所述表达方法使用一种由14个氨基酸残基组成的生物素受体肽，将该生物素受体肽的编码基因通过一对特异性引物与PCR技术扩增到荧光素酶编码基因的上游，获得该生物素受体肽和荧光素酶的融合编码基因，再将该融合编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体，该重组表达载体在大肠杆菌宿主细胞中能够表达生物素受体肽和荧光素酶素酶的融合蛋白，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰；其中，所述的生物素受体肽的序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种生物素化荧光素酶的表达方法，其特征在于：所述表达方法使用一
种由14个氨基酸残基组成的生物素受体肽，将该生物素受体肽的编码基因通过
一对特异性引物与PCR技术扩增到荧光素酶编码基因的上游，获得该生物素受
体肽和荧光素酶的融合编码基因，再将该融合编码基因构建到大肠杆菌表达载
体中，获得重组表达载体，该重组表达载体在大肠杆菌宿主细胞中能够表达生
物素受体肽和荧光素酶素酶的融合蛋白，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞
内被生物素化修饰；其中，所述的生物素受体肽的序列为SEQIDNO：1所示的
氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述表达方法包括以下步
骤：
⑴.选择需要生物素化的荧光素酶，设计一对特异性引物；该引物对中的正
向引物从5’端到3’端依次是上游酶切位点、权利要求1所述的生物素受体肽
的编码基因以及与荧光素酶编码基因的正向扩增引物；该引物对中的反向引物
从5’端到3’端依次是下游酶切位点以及与荧光素酶编码基因的反向扩增引物；
⑵.合成步骤⑴所述的引物对，并通过PCR扩增生物素受体肽和荧光素酶的
融合编码基因；
⑶.将步骤⑵扩增所得的融合编码基因构建于大肠杆菌表达载体中，获得重
组表达载体；
⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工
程菌；...

【专利技术属性】
技术研发人员：高静，蔡亦梅，吴超，徐潇，张睿，王者馥，王绪敏，殷金龙，任鲁风，
申请(专利权)人：北京中科紫鑫科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11