本发明专利技术涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种猪miR‑122基因的启动子区突变位点的分子标记方法及其在猪抗猪圆环病毒病育种中的应用，发明专利技术人发现在不同品种猪中miR‑122的启动子区存在多处差异，其中－4845位点处存在7bp碱基的插入/缺失，通过荧光素酶报告基因系统发现，有7bp碱基插入的启动子荧光素酶活性显著高于7bp碱基缺失的启动子荧光素酶活性。可见通过检测猪基因组中miR‑122基因启动子区－4845位点的基因型作为与猪抗猪圆环病毒病性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
A breeding method for screening anti Porcine Circovirus Disease of swine miR 122 promoter molecular marker technique and its application
The present invention relates to the field of molecular genetics, specifically related to the application of molecular markers in promoter region of porcine miR 122 gene mutation and anti Porcine Circovirus Disease in pig breeding, the inventor found in different pig breeds in the promoter region of miR 122 there are many differences, which are the insertion / deletion 7bp - 4845 base site, luciferase reporter gene system found promoter luciferase activity of 7bp insertion was significantly higher than that of 7bp deletion promoter luciferase activity. Visible through the detection of porcine genome miR 122 gene promoter genotype promoter - 4845 loci as molecular markers and pig anti porcine circovirus associated traits, not only the method is simple and rapid, and is not affected by the environment, and can realize the early selection.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种筛选抗猪圆环病毒病猪的育种方法，通过判断猪ssc-miR-122的启动子区突变位点的多态性来进行选种，并人为的应用该突变位点实现优良育种。
技术介绍
自1982年Tischer等在PK15细胞中发现猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)以来，对其的研究已有约34年的历史。PCV分为无致病性的PCV1和强致病性的PCV2两种亚型。PCV2主要感染5～15周龄的猪，致死率约为15％。它是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)、呼吸道疾病综合征(PRDS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)的主要病原(Stevensonetal.,2001)。PCV2感染机体后能引起免疫抑制，在与其它病原体一同共感染或继发感染时，将会加重病情，严重的则会造成机体死亡。猪的抗病性状属于中等遗传力水平的阈性状，对病毒引起的疾病所产生的抗性是可以遗传的。Opriessnig等的研究发现，在感染PCV2后，皮特兰猪所表现出的临床症状最为严重，长白猪次之，杜洛克猪和大白猪的症状表现相对较轻。同时，本研究团队前期的研究发现在感染PCV2后，大长杂交猪表现出日增重减慢、体温升高、腹泻、皮肤出现紫斑以及肺脏和脾脏出现充血、出血等症状，而莱芜猪却表现温和，无明显病变。以上结果表明不同品种猪对PCV2的抗性存在遗传差异，地方品种猪抗PCV2的能力较强。猪不同品种间对PCV2的抗性存在遗传差异，这为抗猪圆环病毒病猪的育种提供了基础和前提。莱芜猪具有抗病耐粗、多胎高产、哺育力强、肉质好等优良特性。调查显示，自2000年以来，在西方猪种PCV2感染率及死亡率呈逐渐升高的趋势，而我国地方品种莱芜猪未出现PCV2感染的报道，表现出对PCV2强的抗感染能力。本研究团队利用数字表达谱测序对比了抗病性强的莱芜猪和易感的大长杂交猪感染PCV2后肺脏组织表达谱的差异，筛选出大量差异表达的microRNA，实时定量RT-PCR试验验证了攻毒后的莱芜猪的肺脏中miR-122表达量显著高于未攻毒莱芜猪；而在大长杂交猪中的表达相对稳定(图1)。这提示了ssc-miR-122基因可能与猪圆环病毒病的抗性有关。miR-122是一种专一表达于成年人肝脏的miRNA，位于人的18号染色体上，在一个肝脏特异性表达的转录单元内，而猪miR-122位于1号染色体。miR-122是一个较长前体非编码基因转录本通过剪切后而产生，启动子具有较高的保守性，miR-122前体基因启动子区位于miR-122保守茎环序列上游约5kb处，包含多个核受体因子结合序列，如RNA聚合酶II所识别的启动子顺式元件TATA-box等，利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术，确定了这些元件对于miR-122基因表达具有十分重要的调节作用。MiR-122有促进肿瘤细胞凋亡的作用，并可参与肝细胞发育、肝细胞表型、分化代谢和肝细胞应急应答等多种生理活动。通过对比莱芜猪和大长杂交猪miR-122基因的启动子区系列，找到多处核苷酸序列的不同。对－4845位点存在的7bp碱基插入/缺失的多态进行了进一步研究。我们的研究表明miR-122基因－4845位点的7bp碱基缺失后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示该位点的7bp碱基插入可能有增强miR-122基因转录的功能。由于miR-122的稳定表达和猪抗圆环病毒病相一致，因此通过检测该分子标记，选择miR-122高表达的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗圆环病毒病特性具有重要的意义。
技术实现思路
基于上述的原因，本专利技术通过筛选出猪抗猪圆环病毒病相关的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪抗病品种培育提供基因标记和技术方法。根据现有技术，专利技术人通过进一步的实验发现猪miR-122启动子区－4845位点的7bp碱基插入/缺失突变在体外试验中改变了miR-122启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。本专利技术提供的一种筛选抗猪圆环病毒病猪的miR-122分子标记育种方法，该方法通过测定从该动物获得的DNA样品中miR-122启动子多态性来实现的；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；所述的多态性是与抗猪圆环病毒病相关的多态性。其具体方法如下：(1)猪基因组DNA的获得；(2)分别以上述猪基因组DNA为模板，扩增miR-122的启动子区序列；(3)限制性内切酶酶切方法构建不同载体，通过细胞培养和转染技术，利用双荧光素酶报告系统检测不同载体的表达情况，找出调控基因表达的关键元件；(4)鉴定miR-122启动子区多态性；(5)荧光素酶报告系统检测定点突变位点对基因表达的影响；(6)群体检测－4845位点的多态性及标记辅助育种。具体的标记方法为：采用标记引物，包括miR122F：5′-CGGGGTACCTCCTGCTGAGTGTGCTTGA-3′其序列如SeqIDNo：1所示；miR122R：5′-CTAGCTAGCAACCTTGTGAGTGTTCCG-3′其序列如SeqIDNo：2所示；我们的研究表明miR-122基因－4845位点的7bp碱基缺失后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示－4845位点的7bp碱基插入可能有增强miR-122基因转录的功能。结合基因表达谱及荧光定量PCR结果可以看出miR-122基因的高表达与对猪圆环病毒的抗性有关。通过分子标记筛选含有7bp碱基插入等位基因的猪群进行育种，可以获得miR-122高表达的个体，对于提高猪群的抗猪圆环病毒病特性具有重要意义。综上所述，本专利技术人通过实验发现猪miR-122启动子区－4845位点的7bp碱基插入/缺失突变在体外试验中改变了miR-122启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。附图说明图1为猪miR-122基因在肺脏的荧光定量PCR结果；图2为miR122F和miR122R引物PCR扩增猪miR-122启动子-5143至-3594片段电泳图；图3为构建删除载体，转染PK15细胞荧光素酶检测结果；图4为miR122F和miR122R引物PCR扩增猪miR-122启动子-5143至-3594片段多态位点检测结果；图5为荧光素酶系统分别检测含有7bp碱基插入和缺失的启动子载体的荧光素酶活性结果；具体实施方式在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。实施例1猪miR-122启动子区序列的克隆基因组提取：取莱芜猪和大长杂交猪耳组织，按照TIANGEN公司TIANampGenomicDNAKit的说明书进行基因组DNA提取。根据miR-122启动子的基因序列(NCBIReferenceSequence:NC_010443.4)设计如下引物miR122PF基因序列如SeqIDNo:1所示，miR122PR基因序列如SeqIDNo:2所示，它包含了从miR-122前体上游3594bp到上游5143bp的范围(序列如SeqIDNo:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种筛选抗猪圆环病毒病猪的辅助育种方法，其特征在于：该方法通过测定从该动物获得的DNA样品中miR‑122基因的多态性来实现的；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；所述的多态性是指能使miR‑122基因高表达并与抗猪圆环病毒病相关的多态性。
【技术特征摘要】
1.一种筛选抗猪圆环病毒病猪的辅助育种方法，其特征在于：该方法通过测定从该动物获得的DNA样品中miR-122基因的多态性来实现的；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；所述的多态性是指能使miR-122基因高表达并与抗猪圆环病毒病相关的多态性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体方法如下：(1)猪基因组DNA的获得；(2)以上述猪基因组DNA为模板，扩增miR-122基因的启动子区序列；(3)鉴定miR-122基因的启...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜运良，张萍，孙亿，刘根，鹿红宇，王岩超，王昱丁，马才，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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