一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述重组载体介导的荧光素酶基因在raji细胞中表达荧光素酶，利用酶催化底物反应原理，应用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪，从而评判CAR‑T细胞的靶向杀伤效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种重组载体及其应用，具体涉及一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用。
技术介绍
荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因。近年来，光学报告基因成像因具有灵敏度高、无放射性、成像迅速且可实时监测等诸多优点，成为分子影像学研究中的热点，并因此成为体内示踪细胞的理想成像方法。光学报告基因成像技术主要包括生物发光成像和荧光成像两大类。Raji细胞为人B淋巴瘤白血病细胞，该细胞系最初来源于一名黑人男性Burkitt淋巴瘤患者的左上颌骨，由R.J.v.Pulvertaft在1963年建立；为B淋巴细胞来源，表达B系相关表型，呈淋巴母细胞形态；2倍体核型，EBV(+)；体外培养呈悬浮生长。CD19为B细胞表面分化抗原，只在正常和恶性B细胞表达，几乎不在其他组织表达。到目前为止，淋巴瘤的治疗以化疗为主，但大部化疗药物均有局限性，且对病人的免疫系统产生很大的损害，疗效往往不尽人意。因此副作用小，治愈率高的靶向性生物治疗给患者带来了希望，成为近年来研究的热点问题。CN103468730A公开了一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体的构建及应用，其可用于检测候选microRNAs对猪CD163基因表达的调控活性及用于筛选抑制猪CD163基因表达的microRNAs等。但目前的荧光素酶基因并没有相关报道与pCDH载体相连，也没有将荧光素酶基因用于CD19的追踪。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用，通过该重组载体介导的荧光素酶基因在raji细胞中表达荧光素酶，利用酶催化底物反应原理，应用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪，从而评判CAR-T细胞的靶向杀伤效果。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体(pCDH-Luc)，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术中，所述慢病毒载体pCDH可用现有技术中存在的慢病毒载体pCDH即可。所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列见序列表。优选地，所述荧光素酶基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述SEQIDNO.2的氨基酸序列如下：MADAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV.优选地，所述荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。所述SEQIDNO.3所示的核苷酸序列见序列表。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：(1)根据序列设计引物，以pET28-Luc为模板进行扩增，得到一个替换了酶切位点的基因片段；(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段连接到pCDH载体中，构建重组质粒；(3)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。优选地，步骤(1)所述引物为SEQIDNO.4-5所示的核苷酸序列；所述SEQIDNO.4-5所示的核苷酸序列如下：SEQIDNO.4：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT；SEQIDNO.5：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA。优选地，步骤(3)所述将扩增得到的基因片段连接到pCDH载体的BamHI和NotI克隆位点。第三方面，本专利技术提供一种重组慢病毒，如第一方面所述的重组载体与pFUGW表达载体及包膜载体pVSV-G载体进行共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。第四方面，本专利技术提供一种宿主细胞，包括如第一方面所述的重组载体或如第三方面所述的重组慢病毒。优选地，所述宿主细胞为293T、293FT或293LTV中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。第五方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的重组载体，如第三方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的宿主细胞用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术中荧光素酶报告基因是生物发光成像的报告基因，生物发光成像较荧光成像具有更高的灵敏度，无明显自发荧光，背景噪声低，图像信噪比更高；将慢病毒表达载体pCDH作为活体成像示踪载体，具有高感染力的特点，可有效地感染各种类型的细胞，尤其是一些难感染的细胞，比如表达CD19的Raji细胞，而荧光素酶在生物体内具有高度催化荧光反应的功能，两者结合构建的重组载体有两方面优势：一是容易制得大量重组载体pCDH-Luc，二是可精准直观的示踪生物体内CD19+细胞的变化。附图说明图1为本专利技术pCDH-Luc质粒图谱；图2为本专利技术pET28-Luc质粒的酶切鉴定结果图；图3为本专利技术pCDH质粒的酶切鉴定结果图；图4为本专利技术pCDH-Luc质粒的酶切鉴定结果图；图5为本专利技术pCDH-Luc重组载体序列鉴定结果。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内。实施例1：构建pCDH-CAR19慢病毒载体pCDH-Luc慢病毒载体，如图1所示：(1)根据已知pET28-Luc为模板进行酶切位点引物更换设计引物如下：上游引物：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT(BamHI-Luc-A)；下游引物：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA(Luc-NotI-S)；为了方便构建重组载体pCDH-Luc，我们在合成Luc时人为的加入了载体构建时所需的酶切位点BamHI和NotI。PCR扩增反应体系如下：其中，一组以水为样本的阴性对照。反应条件如下：获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，加入NotI和BamHI进行酶切反应，得到的Luc片段与pCDH进行连接反应，反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体，其特征在于，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体，其特征在于，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述荧光素酶基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据序列设计引物，以pET28-Luc为模板进行扩增，得到一个替换了酶切位点的基因片段；(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段连接到pCDH载体中，构建重组质粒；(3)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦丹，赵礼军，连杰，李德志，付苏雷，吴雷振，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41