本公开提供修饰的胞嘧啶脱氨酶(CD)。本公开还涉及表达或包含此类修饰CD的细胞和载体以及使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。具体地，本文提供将5-FC转变成5-FU的多肽，还提供编码此类多肽的核酸分子、表达此类多肽的细胞、包含此类多核苷酸和多肽的载体以及适宜地使用此类多肽合成5-FU或其衍生物的方法。本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。所述多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸。本文还提供编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸为人密码子优化的多核苷酸。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请日为2009年9月26日，专利技术名称为"基因治疗载体和胞嘧啶 脱氨酶"、PCT国际专利申请PCT/US2009/058510进入中国国家阶段的中国专利申请号 200980147509. 6的分案申请。 与相关申请的交叉引用 本申请要求于2008年9月26提出的美国临时申请系列号61/100, 666、于2008年 12月8日提出的美国临时申请系列号61/120,618和于2009年6月13日提出的美国临时 申请系列号61/186, 823的优先权，它们的公开内容通过引用并入本文。
本公开涉及修饰的胞嘧啶脱氨酶（⑶）。本公开还涉及表达此类修饰⑶的细胞和 使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。
技术介绍
酵母或细菌胞嘧啶脱氨酶将无毒性的抗生素前体药物5-FC转变成细胞毒性的化 学治疗剂5-氟尿嘧啶（5-FU)。尚不知晓人（一般而言，哺乳动物）具有编码具有显著胞嘧 啶脱氨酶活性的酶的天然存在基因。酵母和细菌胞嘧啶脱氨酶在使用基因递送和病毒载体 用于递送酶、然后用5-FC治疗的癌症治疗中得到认可，其中5-FC然后被酶转变成细胞毒性 药物（Miller等，CanRes62:773-780 2002;Kievit等，CanRes59:1417-1421 1999)〇
技术实现思路
本文提供将5-FC转变成5-FU的多肽。还提供编码此类多肽的核酸分子、表达此 类多肽的细胞、包含此类多核苷酸和多肽的载体以及适宜地使用此类多肽合成5-FU或其 衍生物的方法。因此，在多个实施方案中，提供了包含具有SEQIDN0 :2所示序列的胞嘧啶 脱氨酶的分离的或重组的多肽。在其它实施方案中，多肽包含具有选自A23L、V108I、I140L 及其任何组合的突变的SEQIDNO:2。在又一实施方案中，多肽包含SEQIDNO:4中所示 序列并且包括除残基：（a) 23、108和140之外的可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。通 常，本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。 本公开还提供包含与SEQIDN0 :4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列 的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮 氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多肽包含SEQIDN0 :4中 所示序列。 本公开还提供包含可操作连接至尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT)或乳清酸磷酸 核糖基转移酶（0PRT)的任何一种前述多肽的融合构建体。在一个实施方案中，融合构建 体包含连接至具有UPRT或0PRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有选自 A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQIDN0:2。在又一实施方案中，融合构建 体包含具有SEQIDN0 :4中所示序列的第一多肽并且包括除残基23、108和140之外可达 50、25、10或5个保守氨基酸取代，其中第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。 本公开还提供融合构建体，其包含具有胞嘧啶脱氨酶活性并且含有与SEQIDNO:4至少 80%、90 %、95 %、98 %或99%相同的序列的第一多肽，其中该多肽在第23位具有亮氨酸， 在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽连接至包含UPRT 或0PRT活性的第二多肽。在一个实施方案中，具有UPRT或0PRT活性的多肽包含分别在 SEQIDNO:8和10中所示序列或其变体。在又一实施方案中，包含胞嘧啶脱氨酶活性的第 一多肽连接至具有UPRT或0PRT活性的多肽，其中多肽通过肽连接体分开。在另一实施方 案中，融合构建体包含选自SEQIDNO:12、14、16或18的序列。 本公开还提供编码任何前述多肽的多核苷酸。例如，本公开提供多核苷酸，所述 多核苷酸编码包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQIDN0:2的多 肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQIDNO:4所示序列的多肽并且包括除残基： (a) 23、108和140外可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。在进一步的实施方案中，本公开 提供多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQIDN0:4至少80%、90%、95%、98 %或99 % 相同的序列的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140 位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多核苷酸编码包 含SEQIDN0:4的多肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQIDN0:4、6、8、10、ll、 12或13所示序列的多肽。 本公开提供编码胞嘧啶脱氨酶的人密码子优化的多核苷酸。在一个实施方案中， 人密码子优化的多核苷酸包含SEQIDN0 :3所示序列。在又一实施方案中，多核苷酸包含SEQIDN0 :5、7或9所示序列。 在其它实施方案中，本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体使用基因递送系统 (GDS)递送。在另一方面中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸使用其为病毒或病毒衍生载体的 GDS递送。病毒载体可以是复制型或者非复制型，并且可以是腺病毒载体、麻疹病毒载体、 疱疹病毒载体、反转录病毒载体（包括慢病毒载体）、弹状病毒载体例如水泡性口炎病毒载 体、呼肠孤病毒载体、矽尼卡谷病毒载体、痘病毒载体（包括动物疹或痘病毒衍生的载体）、 细小病毒属载体（包括AAV载体）、甲病毒属载体或本领域技术人员已知的其它病毒载体。 在一个实施方案中，病毒载体可以是能感染正在复制的哺乳动物细胞的可复制型反转录病 毒载体。可复制型反转录病毒载体可以包括正反转录病毒（Orthoretrovirus)或更有代表 性的γ反转录病毒载体。在一个方面中，可复制型反转录病毒载体包含在编码本公开胞嘧 啶脱氨酶的多核苷酸5'端的内部核糖体进入位点（IRES)。在一个实施方案中，编码胞嘧啶 脱氨酶的多核苷酸在反转录病毒载体ENV多核苷酸的3'端。 在其它实施方案中，提供用本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体或者包括本公开 多核苷酸或融合构建体的载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆 虫细胞或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞，例如细菌细胞。 本公开还提供治疗细胞增殖性病症（包括癌症）的方法，包括向受试者施用本公 开的多核苷酸或多肽和使受试者接触包含5-氟胞嘧啶（5-FC)的细胞毒性药物。 本公开提供重组的可复制型反转录病毒（RCR)，包含：反转录病毒GAG蛋白；反转 录病毒P0L蛋白；反转录病毒包膜；包含位于反转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复 (LTR)序列、位于反转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构 域和env核酸结构域的反转录病毒多核苷酸，所述启动子适宜于在哺乳动物细胞中表达； 包含可操作连接至异源多核苷酸的内部核糖体进入位点（IRES)的盒，其中盒位于3'LTR的 5'端并且位于编码反转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端；和在靶细胞内进行反转录、 包装和整合必需的顺式作用序列，其中与PACE载体（SEQIDNO:21)相比，RCR在6次传代 后保持了较高的复制能本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的多核苷酸，包含：编码SEQ ID NO：4的多肽的人密码子优化的多核苷酸，其中所述多肽包含胞嘧啶脱氨酶(CD)活性。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：哈利·E·格鲁贝尔，道格拉斯·乔利，奥马尔·佩雷斯，克里斯托弗·R·洛格，
申请(专利权)人：托卡根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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