含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒、含该表达盒的微环DNA及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒及其制备方法，该微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成位点特异性重组，消除原核质粒元件，形成含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA；本发明专利技术还提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA及其制备方法和应用，该微环DNA可在宿主细胞内稳定、持久地表达基因工程抗体基因，是一种高效、安全的基因治疗载体；其次，本发明专利技术还提供了一种含有该微环DNA的宿主细胞及其制备方法和应用；此外，本发明专利技术还提供了一种基因工程抗体及其制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒及其制备方法，该微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成位点特异性重组，消除原核质粒元件，形成含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA；本专利技术还提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA及其制备方法和应用，该微环DNA可在宿主细胞内稳定、持久地表达基因工程抗体基因，是一种高效、安全的基因治疗载体；其次，本专利技术还提供了一种含有该微环DNA的宿主细胞及其制备方法和应用；此外，本专利技术还提供了一种基因工程抗体及其制备方法和应用。【专利说明】含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒、含该 表达盒的微环DNA及应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种含基因工程抗体基因表达盒的微环 DNA重组母质粒及其构建方法和应用，和一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA及其 构建方法和应用，一种具有含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞及其应用， 以及一种基因工程抗体及其表达方法和应用。
技术介绍
临床上，重组抗体已被用来治疗各种疾病，包括癌症和自身免疫性疾病等。但是目 前基因工程抗体一般是在体外生产后再注射到体内进行治疗，这种方式有多种缺点，比如： (1)生产、包装、运输、保存等环节花费大、成本高；（2)蛋白抗体药物纯度不高，污染物存在 副作用，有安全隐患；（3)抗体的半衰期短，需反复注射，有时还需要用微泵给药法维持体 内抗体的有效浓度，加大了抗体临床应用的难度，且治疗费用高昂。 基因治疗采用基因转染的方式将治疗性基因转染到人体靶细胞，是避免直接注射 蛋白抗体药物存在的问题的有效途径之一。在基因治疗中，采用有效的载体高效、安全地将 目的基因转移至宿主细胞内表达非常重要，在临床应用的基因治疗载体中，主要有重组腺 病毒载体、逆转录病毒载体和质粒载体。其中，病毒载体在体内的转染率高，但制备病毒载 体的费用高昂，且病毒载体存在插入突变的风险和免疫原性，会带来诱癌风险并可能引发 患者致命的免疫反应。传统的质粒载体比病毒载体安全，但比病毒载体的转染率低，且外源 基因只能瞬时表达，如要稳定持久地表达，载体必须整合到宿主细胞染色体上，而载体的随 机整合会引起插入突变或导致外源基因的沉默，此外，传统质粒载体中含有细菌复制序列、 抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隐减的表达彳目号，这些序列在质粒复制时是必 需的，但在基因治疗中可能引起严重的生物安全性问题。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术实施例第一方面提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环 DNA重组母质粒，该微环DNA母质粒能在宿主菌内完成微环DNA的重组过程，消除原核质粒 元件。 本专利技术实施例第二方面提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组 母质粒的构建方法。 本专利技术实施例第三方面提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA，该微 环DNA可游离于宿主细胞基因组DNA之外稳定持久的表达基因工程抗体基因。 本专利技术实施例第四方面提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA的构 建方法。 本专利技术实施例第五方面提供了一种具有含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA 的宿主细胞。 本专利技术实施例第六方面提供了 一种基因工程抗体。 本专利技术实施例第七方面提供了一种基因工程抗体的表达方法。 本专利技术实施例第八方面提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组 母质粒、含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA、具有含基因工程抗体基因表达盒的微环 DNA的宿主细胞和基因工程抗体的应用。 第一方面，本专利技术提供了一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质 粒，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点（MCS)中插入基因工程抗体 基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2〇C31质粒或pMC.BESPX 质粒，所述基因工程抗体基因表达盒包括依次连接的启动子、编码免疫球蛋白k链信号肽 的碱基序列、编码Flag标签的碱基序列、基因工程抗体基因、编码组氨酸His6标签的碱基 序列、终止密码子和polyA加尾信号。 优选地，所述基因工程抗体基因具有编码基因工程抗体的碱基序列，所述基因工 程抗体为双靶向特异性抗体，所述双靶向特异性抗体具有靶向免疫效应细胞抗原表位的结 合位点和肿瘤细胞抗原表位的结合位点。 进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中 的一种。 进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、 胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和 甲状腺癌细胞中的一种。 以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本专利技术 所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。 进一步优选地，所述双祀向特异性抗体祀向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表 位。 优选地，所述p2 质粒构建方法参照ChenZYetal.，MinicircleDNA vectorsdevoidofbacterialDNAresultinpersistentandhigh-leveltransgene expressioninvivo,MolecularTherapy，2003,Volume8,Number3,495-500、ChenZY etal. ,ImprovedproductionandpurificationofminicircleDNAvectorfreeof plasmidbacterialsequencesandcapableofpersistenttransgeneexpressionin vivo,HumanGeneTherapy，2005,Volumel6，Numberl，126-131 和美国专利US7897380B2。 优选地，所述pMC.BESPX质粒的全基因序列如ChenZYetal.，Arobustsystem forproductionofminicircleDNAvectros，NatureBiotechnology，2010,Volume28，Nu mberl2, 1289-1291 所述。 优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC 启动子和延长因子EF1a启动子。 进一步优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子。 优选地，所述巨细胞病毒CMV启动子的碱基序列如SEQIDN0:23所示。 本专利技术采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EFla等真核表达启动子 之一，CMV启动子只是本专利技术构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本专利技术可以根据表达 宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。 本专利技术提供的免疫球蛋白k链信号肽有助于基因工程抗体基因的分泌。 优选地，所述免疫球蛋白k链信号肽的碱基序列如SEQIDN0:24所示。 本专利技术提供的Flag标签有助于基因工程抗体基因的表达，且比其他常用标签如 c-myc、谷胱甘肽-S转移酶（GST)、流感病毒血凝素表位（HA)或绿色荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含基因工程抗体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中插入基因工程抗体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述基因工程抗体基因表达盒包括依次连接的启动子、编码免疫球蛋白κ链信号肽的碱基序列、编码Flag标签的碱基序列、基因工程抗体基因、编码组氨酸His6标签的碱基序列、终止密码子和polyA加尾信号。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志英，马飞，何成宜，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，深圳市合一康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44