具有多功能的瞬时表达病毒载体体系制造技术

本申请揭示了适用于木本树木转染的病毒载体，主要用于传递和表达有益的基因。本申请具体说明的是用于感染柑橘属果树的载体。该载体可以表达有用的蛋白质，例如那些可以保护树木不受疾病伤害的蛋白质。本申请具体说明的是转染木本树木的方法，可以在避免双重感染的同时实现载体的多样化应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】具有多功能的瞬时表达病毒载体体系相关申请的交叉参考本申请根据美国法典第35篇第119条(35 USC 119)要求2010年8月8日提交的美国专利申请第61/321，970号和2011年2月8日提交的美国专利申请第61/440，445号的优先权。专利
专利技术的初始实施例与一个基于病毒的瞬时表达载体有关，该载体可以长时间在子系中表达外来基因，从而允许在同一时间或者稍后对同个子系使用相似的载体。其他实施例与病毒载体结构和方法有关，这些方法可以避免排除双重感染，从而使载体的应用多样化。
技术介绍
基于病毒的瞬时表达载体是世界上植物分子生物学实验所用的常用工具，它可以快速表达或者沉默植物中的基因。它们也是植物基因组学中的重要工具，可以筛选某功能的位置序列。但是，只能从草本植物的有限数量的类似病毒中开发可用的载体。比较著名的例子有基于烟草花叶病毒(TWV)的载体(Dawson et al.，1989 ；Donson et al.，1991 ；Shivprasad et al.，1999 ;Rabindran 和 Dawson，2001)。木本植物的挑战更为特殊。即使存在可以感染树木的载体，系统感染和分析树木中表达基因所需的时间一般都超出了已知基于病毒的载体的稳定性。但是生殖限制以及改良树木所需的几十年时间带来的挑战增加了有用的基于病毒的载体的需求。柑橘特里斯德察病毒(CTV)是复杂的长线病毒家族中的一员，该家族的病毒有单分、双分和三分的基因组，由部分昆虫载体传递，包括蚜虫，烟粉虱和粉蚧(Bar-Jos印het al.，1979 ;Dol ja et al., 1994 ；Agranovsky, 1996 ；Karasev, 2000) 0 CTV 的长弯曲病毒子(2000nm X 10_12nm)被两个外壳蛋白包被；主要的外壳蛋白(CP)覆盖大约97%的病毒子，而非主要的外壳蛋白(CPm)负责将另一个末端包入壳内。CTV的单链RNA基因大约为 19.3kb，被分成十二个开放阅读框(ORFs) (Pappu et al.，1994 ；Karasev et al.，1995)(图1)。ORF Ia编码一个349kDa大小的多蛋白质，此蛋白包括两个类木瓜蛋白酶的蛋白酶区域以及类转甲基酶和类解旋酶区域。多蛋白的翻译被认为通过在类聚合酶区域(0RFIb)的a+Ι移码可以继续进彳丁。ORFs Ia和Ib加上非编码末端都是原生质体复制所必需的(Satyanarayana et al.，1999)。十个 3' ORFs 通过 3'共末端亚基因(sg)mRNAs 表达(Hilf et al.,1995 ；Karasev et al.，1997)。除了两个外壳蛋白质外，p65 (HSP70 同源)和P61是有效的病毒体组装所需的，而且是病毒在原生质体之间传代所需的，从而丰富柠檬树感染的接芽(Satyanarayana et al.，2000)。p6蛋白质是植物感染所需的，同时p20和p23蛋白质以及CP是RNA沉默的抑制子(Lu et al.，2004)。CTV可以感染并在一些被删除部分病毒基因的柑橘属果树变种中移动。CTV在病毒体复制或者形成中不需要的基因组的3’部分中包含五个基因，即p6、p33、pl8、pl3和p20。p33、pl8和pl3在此类病毒群的其他成员中并不保守，而且被认为已经进化从而保证与柑橘属宿主的特异相互作用。我们发现，p33、pl8或者pl3 ORF中的删除分别都会导致病毒感染、扩增和在柑橘属果树之间的传播能力发生不严重的丢失(Tatineni et al.，2008)。而且p33、pl8或者pl3基因中任意组合的删除会使病毒从整体上侵染柑橘属果树，包括所有三个基因的删除。绿色荧光蛋白标记的CTV突变和p33 ORF或者p33、pl8和pl3ORF中的删除证明这些删除变异的移动和分布与野生型的病毒类似。在双重感染排除或者同源干扰中，先前存在的感染会阻止同个或者相近的病毒的二次感染，但是不能影响无关病毒的感染。此现象首先由McKinney (McKinney，1926 ；1929)在两个基因型的烟草花叶病毒(TMV)之间发现，随后也在噬菌体(Dulbecco，1952 ;Visconti, 1953)中发现。自此之后，经常也在动物(Adams和Brown，1985 ;Bratt和Rubin，1968 ；Delwart 和 Panganiban，1989 ;Geib et al.，2003 ;Johnston et al., 1974 ；Karpfet al.，1997 ;Lee et al.，2005 ;Singh et al.，1997 ;Steck 和 Rubin，1966 ;Strauss 和Strauss, 1994 ；ffhitaker-Dowling et al.，1983 ；ffildum et al.，2006)和植物(Bennett，1951 ；Fulton, 1978 ;Gal_0n 和 Shiboleth，2005 ;Hull 和 PlaskUt，1970 ;Hull，2002 ；Lecoqet al., 1991 ；Salaman, 1933 ；ffalkey et al.，1992)病毒中观察到这一现象。在植物病毒学中，同源干扰最先被用作病毒相关性的检测，用来确定两个病毒分离株是同个病毒的“品系”或者是代表着不同的病毒(McKinney，1929 ;Salaman，1933)。随后，这项技术被发展成一个管理工具，通过使用温和病毒分尚株有目的地感染植物来减少更严重的病毒分尚株的感染以及造成的损失，从而减少了农作物的损失，这被称为“交叉保护”(MGal-On和Shiboleth，2005 以及 Hull，2002 的综述)。【附图说明】图1中⑷为野生型CTV T36(T36 CTV9R)基因组织的简图。(B)和(C)分别为Ap33 CTV结构和被前蛋白酶区域取代的杂交结构图示。空白方框表示ORF及其翻译产物。PR0，类木瓜蛋白酶区域；MT，转甲基酶；HEL，解旋酶；RdRp，一个RNA依赖的RNA聚合酶；HSP70h，HSP70同源物；CPm，非主要的外壳蛋白质；CP，主要外壳蛋白质。黑框分别表示T36基因组中替代的T68-1序列。箭头指出p33 ORF删除的位置。图2显示了被来自T68-1分离株(黑框)蛋白酶区域进入到T36基因组替代的杂交病毒的图示。下方:感染T36分离株或者单独感染杂交LlL2h (第2、3道)检测病毒在植物中的增殖；第4道表示的是LlL2h在预感染T36的植物中的增殖。通过反转录PCR反应来分析病毒扩增，其中每个反应混合物中都有I套引物:一套是T36蛋白酶特异性，另一套是针对T68的蛋白酶区域，从而区分T36和LlL2h。专利技术详述病毒倾向于通过相关的病毒来防止双重感染。加入基于病毒的瞬时载体一般会阻止在同样的树木中使用该载体或者相关载体。专利技术者现在也意识到目标生物已经被感染有一个相似的载体之后，有时候在目标生物(例如树木或者植物)中加入载体仍然具有意义。例如，专利技术者发现如果一个植物丢失了正在表达的外来基因，那么能够加入载体将会很必要；如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减轻与对目标生物进行第一个和第二个病毒载体连续接芽有关的病毒载体双重感染排除的方法，第一个病毒载体被构造成前蛋白酶序列和另一个CTV品系被替代，所述的方法包括：使目标生物接芽第一个CTV病毒载体；使第一个CTV病毒载体感染目标生物，从而产生首次感染的生物，并且使初次感染的生物接芽第二个病毒载体，而第二个CTV病毒载体进一步感染初次感染的生物以产生一个二次感染的生物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：多森·O·威廉姆，弗里莫诺娃·斯维特拉娜，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US