本发明专利技术公开了一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用。所述的含HIhh的逆转录病毒载体是将XhoI与NotI双酶切重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP获得的含HIhh片段，与XhoI与NotI双酶切逆转录病毒载体pSFG获得的大片段连接，经转化，酶切鉴定，测序制备得到的，所述的含HIhh的逆转录病毒颗粒是通过含HIhh的逆转录病毒载体转染包装细胞系293GPG制备的。本发明专利技术还涉及上述逆转录病毒载体和逆转录病毒颗粒在制备治疗骨缺陷药物中的应用。本发明专利技术的优点在于为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于治疗骨缺陷的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用，具体地说， 是一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用。
技术介绍
目前，骨缺损的治疗是困扰骨科临床的难点，而传统的治疗方法极为困难。骨组织工程作为医学组织工程的重要组成部分，为骨组织的再生与修复提供了突破点，在治疗骨缺陷方面具有很大的发展潜力。种子细胞、细胞载体支架及组织构建的理论和技术路线是骨组织工程程研究的三大要素。近年来的研究证实，骨生成和形态发生的影响因子对组织工程骨的构建起着关键作用，其中，影响骨再生成功与否的决定因素之一是移植物的再血管化。研究中发现，hdian Hedgehog Ghh)信号通路不仅参与调节骨的生长发育及骨量平衡，还参与血管形成。Ihh基因对软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞均起调节作用，并且对骨组织血管的生成及维持有重要意义。在骨发育方面，Ihh信号通路主要参与促进骨髓间充质干细胞(MSCs细胞)向成骨细胞和软骨细胞分化，阻止其向脂肪细胞分化，例如，Ihh 基因参与抑制软骨细胞向肥大的软骨细胞转化。Vortkamp等通过敲除大鼠骺生长板甲状旁腺激素相关肽(Parathyroid Hormone Related ρ印tide，PTHrP)合成基因来研究Ihh基因与PTHrP基因在调节软骨细胞分化方面的关系，发现这两者组成了负反馈调节环。但是 Mak等通过进一步研究发现单独的Ihh可以促进软骨肥大而并不依赖于PTHrP，而骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)和 Wnt/β-catenin 可能具有参与上调 Ihh 信号的功能。另外也有研究表明在关节周围Ihh可不依赖PTHrP而刺激软骨细胞早期分化。这就表明Ihh既可以单独作用于软骨分化，又可以协同PTHrP形成负反馈轴机制，从而维持骨的稳定生长。Ihh促进血管形成的整个过程，包括血管生长、血管成熟。目前，研究的比较透彻的是Shh信号，其在动物缺血模型中可上调血管生长因子如VEGF、BMP4、血管形成素等的表达。同时，Ihh信号在血管系统发生过程也有影响，研究证明Ihh缺失会导致血岛无法形成， 原始的毛细血管网形成障碍，若Ihh突变也会影响血岛与原始的毛细血管网的正常生长发育。这就表明Ihh在调控血管形成中发挥重要的作用。鉴于体外培养的骨组织能否适应体内复杂的微环境很大程度上依赖于骨发育中的信号因子的调控，同时影响骨再生成功与否的决定因素之一是移植物的再血管化，因而， 诱导种子细胞表达Ihh信号蛋白，并且正确调控Ihh信号就成为了组织工程骨成功构建的重要前提。目前，逆转录病毒载体因具有运用范围广泛，高效稳定表达外源基因，转染效率高及可携带较大的目的基因等优点，成为基因转导的重要工具。因此，可以构建含有HIhh (Human indian hedgehog)基因的逆转录病毒载体，通过该载体介导HIhh基因转移进人骨细胞，调控Ihh信号通路，为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。专利文献CN 1656223A，公开日2005年8月17日，公开了一种通过基因治疗的骨生成方法，该专利技术揭示了一种在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括将编码具有骨再生功能蛋白质的基因插入结缔组织细胞，操作性连接于启动子，并将哺乳动物细胞移植入骨缺陷部位，从而使骨缺陷部位形成骨。但是，哺乳动物细胞的移植必将面临移植物的再血管化，如果移植物不能很好地再血管化，则不能和原有骨形成统一的整体，导致骨缺陷治疗的失败。因此，有必要从Ihh信号通路的调控入手，克服影响骨再生成功的关键难点。目前，关于通过逆转录病毒载体调控Ihh的表达来治疗骨缺陷疾病还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种含HIhh的重组载体。本专利技术的第二个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒载体。本专利技术的第三个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒颗粒。本专利技术的第四个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒载体的用途。本专利技术的第五个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒颗粒的用途。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是含HIhh的重组载体，它是由以下方法构建的=HindIII与EcoR V酶切质粒 pIND-HIhh-flag-two 回收 Mhh-flag-two 片段，所述 Mhh-flag-two 片段的粘性末端用 Klenow酶补平并用碱性磷酸酶脱磷酸化，EcoR V酶切质粒pCIG-IRES-EGFP回收大片段，并与Hlhh-flag-two片段连接，转化，酶切鉴定，获得正确连接的质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP。所述的碱性磷酸酶是CLAP酶。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是含HIhh的逆转录病毒载体，它是由以下方法构建的将BioI与NotI双酶切重组载体pCIG-Mhh-IRES-EGFP获得的含HIhh片段，与BioI与NotI双酶切逆转录病毒载体psre获得的大片段连接，经转化，酶切鉴定，测序，获得含HIhh的逆转录病毒载体 pSFG-HIhh-IRES-EGFP。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是含HIhh的逆转录病毒颗粒，它是由含HIhh的逆转录病毒载体转染包装细胞系得到的。所述的包装细胞系是^3GPG。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是含HIhh的逆转录病毒载体在制备治疗骨缺陷药物中的应用。所述的骨缺陷为骨折、断裂和/或骨的退变。为实现上述第五个目的，本专利技术采取的技术方案是含HIhh的逆转录病毒颗粒在制备治疗骨缺陷药物中的应用。所述的骨缺陷为骨折、断裂和/或骨的退变。本专利技术优点在于1、本专利技术的含HIhh的逆转录病毒载体将有助于研究Ihh信号通路与骨发育的分子作用机制，为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。2、本专利技术所使用的逆转录病毒载体pSR；为自体去活载体，即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此在用于骨疾病治疗方面，具有较强的安全性。3、本专利技术采用的标记基因为增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。EGFP因其不用加任何底物，荧光性质稳定，分子量小，对细胞无毒性，使用方便，可进行活细胞实时定位观察等优点在基因治疗、基因转导等方面已得到广泛应用，是一种很有价值的报告基因。因此， 借助标记基因EGFP，可在体内和/或体外对已导入载体的靶细胞进行示踪、富集，更便于对 Ihh信号通路与骨发育的分子作用机制的研究。附图说明附图1是载体pCIG-IRES-EGFP的物理图谱。附图2是逆转录病毒载体psre的物理图谱。附图3是质粒载体pIND-Mhh-flag-two的物理图谱。附图4是含HIhh的重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP的构建示意图。附图5是阳性克隆pCIG -HIhh-IRES-EGFP的酶切验证图谱。附图6是阳性克隆pCIG -HIhh-IRES-EGFP的测序图。附图7是含HIhh的逆转录病毒载体pSre-Mhh-IRES-EGFP的构建示意图。附图8是阳性克隆pSre-Mhh-IRES-EGFP的酶切验证图谱。附图9是^3GPG细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种含ＨＩｈｈ的重组载体，其特征在于，它是由以下方法构建的：ＨｉｎｄＩＩＩ与ＥｃｏＲⅤ酶切质粒ｐＩＮＤ－ＨＩｈｈ－ｆｌａｇ－ｔｗｏ回收ＨＩｈｈ－ｆｌａｇ－ｔｗｏ片段，所述ＨＩｈｈ－ｆｌａｇ－ｔｗｏ片段的粘性末端用Ｋｌｅｎｏｗ酶补平并用碱性磷酸酶脱磷酸化，ＥｃｏＲⅤ酶切质粒ｐＣＩＧ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ回收大片段，并与ＨＩｈｈ－ｆｌａｇ－ｔｗｏ片段连接，转化，酶切鉴定，获得正确连接的质粒ｐＣＩＧ－ＨＩｈｈ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡洪亮，邹沙沙，陈婷婷，张玲玲，马钢，郭熙志，李铮，黄翼然，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：31
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