一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，培养装置由盒体、阀门、连接管、Q‑syte分隔膜密闭式无针接头、Luer‑Lock注射器、过滤器和密闭栓组成，盒体由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体外侧凹入形成矩形容积腔，在盒体的左右两侧有变截面圆柱状通道，通道内固定有母槽连接管，Luer‑Lock注射器的接头为螺旋接头；使用该培养装置前首先进行转导质粒、293T细胞和Huh7.5.1细胞的培养基、原代肝细胞培养基、原代肝细胞组织的制备；使用该培养装置培养得到慢病毒上清液，将慢病毒上清液转染原代肝细胞，培养一定天数后可得到慢病毒载体。

【技术实现步骤摘要】
一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法
本专利技术涉及一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法。
技术介绍
哺乳动物蛋白质的转基因表达可能将正常的体细胞转化为肿瘤发生的状态，例如p53和Rb路径的失活会导致显负性p53蛋白(p53DD)的表达，一个激活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)/细胞周期蛋白复合体(cyclinD1/CDK4R24C)与原癌基因的激活,Ras,和hTERT通路通过致癌的表达形式的原癌基因(c-MycT58A),H-Ras(H-RasG12V)和hTERT,可以驱动不同的人类细胞转化致瘤的状态。研究报道称使用上述的致癌基因组合可以使正常细胞发生致癌细胞转化，这表明正常的肝细胞可能用于基因工程以帮助研究发现在人体癌症的正常转化过程，当它回到宿主肝细胞中时可以形成肿瘤。慢性病毒载体可以转导不可复制细胞同时需要编码肿瘤细胞，细胞培养实验需要在生物安全等级为3级的密闭实验室中进行。然而目前的生物医学试验所使用的培养装置仍然不能很好的保护试验人员。
技术实现思路
为了解决目前技术中存在的问题，本专利技术提出了一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，该专利技术为密闭系统，不会产生慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，其特征在于：培养装置由盒体(1)、阀门(2)、连接管(3)、Q‑syte分隔膜密闭式无针接头(4)、Luer‑Lock注射器(5)、过滤器(6)和密闭栓(7)组成；所述的盒体(1)由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体(1)外侧凹入形成矩形容积腔(12)，在盒体(1)的左右两侧各有一个变截面圆柱状通道，通道内固定有变截面圆柱状的母槽连接管(13)；所述的Luer‑Lock注射器(5)的接头为螺旋接头。

【技术特征摘要】
1.一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，其特征在于：培养装置由盒体(1)、阀门(2)、连接管(3)、Q-syte分隔膜密闭式无针接头(4)、Luer-Lock注射器(5)、过滤器(6)和密闭栓(7)组成；所述的盒体(1)由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体(1)外侧凹入形成矩形容积腔(12)，在盒体(1)的左右两侧各有一个变截面圆柱状通道，通道内固定有变截面圆柱状的母槽连接管(13)；所述的Luer-Lock注射器(5)的接头为螺旋接头。2.一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，其特征在于：慢性病毒载体培养方法包含以下步骤：步骤一、试剂的制备：(1)转导质粒的制备：首先使用PCR对hTERT+p53DD、cyclinD1+CDK4R24C和c-mycT58A+HRasG12V进行增强处理，在CMVV5-LUC受体质粒上的XmaI和KpnI部位之间克隆三个插入序列，并对插入序列进行荧光素酶标记基因操作，得到荧光素标记的pLenti-hTERT+53DD、pLenti-cyclinD1+CDK4R24C和pLenti-c-mycT58A+HRasG12V质粒，使用荧光素酶pLenti-CMVV5作为控制荧光素酶报告基因的控制质粒；(2)293T细胞和Huh7.5.1细胞的细胞培养基(CM)制备：向细胞培养基中添加体积比为10％的灭活胎牛血清，体积比为1％的非必需氨基酸，10ug/mL的庆大霉素；使用0.22um的过滤器过滤后在4℃的环境中保存最多两个月；(3)原代肝细胞(PPH)培养基(WM)制备：向500mL的William’sE培养基添加10mL的质量体积比为7.5％的牛血清蛋白，5mL的ITS-G，10-7M的地塞米松溶液，体积比为1％的非必需氨基酸，体积比为1％的青霉素和链霉素的混合溶液，体积比为1％的稳定性谷氨酸；使用0.22um的过滤器过滤后保存在-80℃的环境中；(4)原代肝细胞(PPH)离析：将肝切成小块组织立即置于含冰块的生理盐水中，在切割表面上插入可视装置，然后在pH为7.4和37℃的环境中使用500mL的缓冲液对肝组织进行灌洗，缓冲液中包含8.3g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES，0.19g/L的EGTA；使用包含100g的IV型胶原酶、3.9g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES和0.7g/L的CaCl2·H2O的400mL缓冲液在37℃的环境中进行第二次灌洗；使用IV型的胶原酶循环灌注，然后移除大块的组织，轻轻摇动存储在冰水中的包含有2.4g/L的HEPESD的HBSS缓冲液即可得到靶细胞；将含有靶细胞的悬浮液通过尼龙网过滤后在4℃的环境中冲洗三次；使用Trypan试剂排斥实验验证得到的肝细胞的可用性；立即使用合格的细胞或者冻结在-80℃的添加有10％的胎牛血清溶液中以代用；步骤二、在密闭式慢病毒载体培养装置中得到慢病毒上清液：(1)培养装置和293T细胞的准备工作：将阀门(2)分别连接培养装置的两侧，在阀门...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，王志华，郑敏，赵辉，向东，张劲松，李珏，唐剑，王连敏，赵松凌，王琨，黄松泉，
申请(专利权)人：昆明医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：云南,53