包装流感病毒载体的信号制造技术

本发明专利技术提供了流感病毒载体的一种包装(导入)信号，以及使用该信号在病毒及细胞中传递和维持流感病毒及外源核酸的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

Signals for packaging influenza viruses

The present invention provides a packaging (import) signal for a flu virus vector, and a method for transmitting and maintaining influenza viruses and exogenous nucleic acids in the virus and cells using the signal.

【技术实现步骤摘要】
包装流感病毒载体的信号本申请是国际申请日为2003年2月12日、国际申请号为PCT/US2003/004233、进入国家阶段的申请号为03808356.6、专利技术名称为“包装流感病毒载体的信号”的PCT申请的分案申请。政府权益声明本专利技术至少有一部分是在美利坚合众国政府的资助下完成的(国立卫生院资助号为AI47446)。政府享有本专利技术中的某些权利。专利技术背景流感病毒A和B的基因组由八段负极性单链RNA片段组成，其中两段编码包膜糖蛋白、血凝素(HA)及唾液酸苷酶(NA)。流感病毒复制以病毒颗粒表面上的病毒HA蛋白与含唾液酸的细胞受体结合为起始。与受体结合后，宿主细胞通过胞饮作用将病毒摄入。晚期核内体中的酸性环境激发HA的构象发生变化，启动病毒包膜与核内体膜之间的融合，并使M2离子通道活化，导致质子流入病毒颗粒内。据认为将病毒颗粒内部暴露于低pH中，可以破坏Ml蛋白和核糖核蛋白(RNP)复合物之间酸依赖性的相互作用，最终使RNP释放入细胞质中。然后RNP会转运到核,在这里合成病毒mRNA及病毒基因组。mRNA进入细胞质中，从而病毒蛋白得以合成。核蛋白(NP)进入核内并用壳体包装新合成的vRNA，并与三种聚合酶亚基蛋白(PA、PB1、PB2) —起形成RNP。当有Ml及NS2蛋白存在时，RNP输出核外。三种浆膜相关蛋白(HA、NA及M2)与RNP相互作用并以芽殖的方式形成新的病毒颗粒。NA负责从细胞的复合糖及病毒糖蛋白中去除唾液酸，从而将病毒从感染细胞中释放出来(Lamb等，2000)。根据HA (Hl~H5)及NA (NI~N9)的抗原性A型病毒分成数种亚型。两种不同的A型病毒所感染的细胞中，可以生成具有各种基因片段组合的类型内重排体(Wright等，2000)。但是，尽管两种病毒均在人类群体共传播，仍未发现A型病毒与B型病毒之间的天然类型间重排体。研究者已尝试在实验室内生成A型和B型病毒之间的重排体，但没有成功(Kaverin 等，1983 ；Mikheera 等，1982 ；Tobita 等，1983)。Muster 等(1991)生成了一种突变A型病毒，其中一个片段的NA片段非编码区由B型病毒非结构性(NS)基因的非编码区片段所取代。尽管此突变病毒的复制比野生型病毒慢得多，所达到的滴度也比野生型低，此类病毒的生成表明B型NS片段的非编码区与A型流感病毒组分在RNA转录及复制水平上是兼容的。相反，当RNA片段所含外源编码片段的旁侧为A型流感病毒RNA片段3'和5’端非编码区时，经过反复传代后不能在病毒颗粒内稳定维持(Luytjes等，1989)。Muster等(1991)也发现突变病毒在小鼠中减毒了，用突变病毒感染的动物可以耐受野生型病毒的攻击。因此需要有一种方法鉴别流感病毒复制期间负责所链接序列导入及/或维持的流感病毒序列。专利技术概沭本专利技术提供了分离重组核酸分子(多核苷酸)，如载体，其中该分子含有流感病毒的导入序列(“包装信号”或vRNA衣壳化信号)及任选异源核酸片段。通常导入序列存在于各流感vRNA片段一端或两端约150至250个核苷酸处。在一个实施方案中，流感病毒导入序列包含与NA3’末端对应的序列，包括与NA编码区N端对应的序列，例如包括3’非编码区19个核苷酸及至少与NA起始19个编码核苷酸对应的序列的A型NA vRNA3’末端37个核苷酸；与任选NA vRNA5’末端对应的导入序列，包括与NA编码区C-末端对应的序列，例如包括5’非编码区28个核苷酸的A型NA VRNASi末端67个核苷酸；以及至少39个与此NA3'编码区39个核苷酸对应的核苷酸。在另一实施方案中,流感病毒导入序列包含与NS vRNA3’末端对应的序列，包括与NS编码区N-末端对应的序列。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与HA vRNA5’末端对应的序列，包括与HA编码区C-末端对应的序列，例如包括5’非编码序列45个核苷酸及至少80个与HA80个3’编码核苷酸对应的核苷酸的A型HA vRNA5’末端135个核苷酸；和任选与HA vRNA3’末端对应的导入序列，包括与HA编码区N-末端对应的序列，例如包括33个3’非编码序列核苷酸及至少3个与HA编码核苷酸起始3个对应的核苷酸的A型HA VRNA5'末端36个核苷酸。在一个进一步的实施方案中，流感病毒导入序列包含与PB2 vRNA5’末端对应的序列，包括与PB2编码区C-末端对应的序列。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与M vRNA3’末端对应的序列，包括与M编码区N端对应的序列，例如包括3’非编码序列26个核苷酸及221个与M编码核苷酸对应的核苷酸的A型M vRNA3’末端247个核苷酸；与M vRNA5’末端对应的序列，包括与M编码区C-末端对应的导入序列，例如包括23个3’非编码序列核苷酸及219个与M编码区C-末端核苷酸最后219个对应的核苷酸的A型M VRNA5'末端242个核苷酸。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与NS vRNA5’末端对应的序列，包括与NS编码区N-末端对应的序列，例如包括3’非编码序列和与NS编码区N-末端对应的至少30个核苷酸的序列；与NSvRNA5’末端对应的序列，包括与NS编码区C端对应的导入序列，例如包括5’非编码序列及与NS编码区C-末端对应的序列的至少30个核苷酸的序列。在一个实施方案中，流感病毒导入序列包含与PBl vRNA5’末端对应的序列，包括与PBl编码区N-末端对应的序列和与PBl vRNA5’末端对应的序列，包括与PBl编码区C-末端对应的导入序列。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与PA vRNA5’末端对应的序列，包括与PA编码区N-末端对应的序列和与PA vRNA5’末端对应的序列，包括与PA编码区C-末端对应的序列。本文所述流感病毒“导入序列”，是指当存在于具有相应(同源)3’及5’非编码区的vRNA中时可使含该序列的核酸分子导入病毒颗粒中并在反复传代过程中使该分子在病毒颗粒中得以维持的序列。正如下文所述，利用基于质粒的反向遗传学已在含截短NA片段的突变病毒中鉴定到了 NA导入序列。该NA导入序列位于一个包括NA VRNA3’末端的区域中，其中该3’末端延伸入部分NA编码区中。因此，该区域可用于包装和维持野生型NA RNA以及突变NARNA,例如内部发生缺失及/或插入的RNA，包括表达目的开放阅读框如含目的开放阅读框的异源核酸片段的重组RNA。也如此处所述，为了深入了解A型与B型流感病毒之间的类型间不兼容性，采用反向遗传学在A型病毒背景下生成含完整B型HA片段的重排体。尽管B型HA片段确实由A型聚合酶复合物进行了转 录，但是并未产生病毒。虽然含由B型HA全部编码序列及其旁侧A型HA非编码序列组成的嵌合HA片段的A型病毒可以存活，但仅能微弱复制。生成一系列基于A型、包含嵌合HA的病毒，其中嵌合HA具有A型非编码区、编码A型病毒信号肽或跨膜/胞浆区或二者均有，以及B型HA来源区域的其它部分。这些病毒在细胞培养物中均长到超过IO6组织培养感染剂量5(1/ml，但是A型HA序列越多则复制情况越好，说明蛋白质-蛋白质相互作用或更多HA片段导入病毒颗粒中对于病毒高效生长起一定作用。与野生型A型本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含流感病毒导入序列的流感病毒载体，该载体包含：a)与流感病毒NA?vRNA3’非编码区对应的序列，3’NA导入序列，异源核酸片段和NA?vRNA5’非编码区；b)与流感病毒HA?vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’HA导入序列和HA?vRNA5’非编码区；c)与流感病毒M?vRNA3’非编码区对应的序列，3’M导入序列，异源核酸片段，5’M导入序列和M?vRNA5’非编码区；d)与流感病毒NS?vRNA3’非编码区对应的序列，3’NS导入序列，异源核酸片段和NS?vRNA5’非编码区；e)与流感病毒PB2?vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PB2导入序列和PB2?vRNA5’非编码区；f)与流感病毒PB1?vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PB1导入序列和PB1?vRNA5’非编码区；或g)与流感病毒PA?vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PA导入序列和PA?vRNA5’非编码区；其中当与该载体对应的vRNA存在于表达流感病毒蛋白并包含除与该载体对应的vRNA之外的vRNA的细胞中时，与该载体对应的vRNA包装入病毒颗粒中。...

【技术特征摘要】
2002.02.13 US 60/356,538;2003.01.07 US 60/438,6791.包含流感病毒导入序列的流感病毒载体，该载体包含: a)与流感病毒NAvRNA3’非编码区对应的序列，3’ NA导入序列，异源核酸片段和NAvRNA5’非编码区； b)与流感病毒HAvRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’ HA导入序列和HAvRNA5’非编码区； c)与流感病毒MVRNA3’非编码区对应的序列，3’M导入序列，异源核酸片段，5’M导入序列和M vRNA5’非编码区； d)与流感病毒NSvRNA3’非编码区对应的序列，3’ NS导入序列，异源核酸片段和NSvRNA5’非编码区； e)与流感病毒PB2vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PB2导入序列和PB2vRNA5’非编码区； f)与流感病毒PBlvRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PB1导入序列和PBlvRNA5’非编码区；或 g)与流感病毒PAvRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’ PA导入序列和PAvRNA5’非编码区； 其中当与该载体对应的vRNA存在于表达流感病毒蛋白并包含除与该载体对应的vRNA之外的vRNA的细胞中时，与该载体对应的vRNA包装入病毒颗粒中。2.权利要求1a)的载体，其中3’NA导入序列包括至少19个与NA起始19个编码核苷酸对应的核苷酸。3.权利要求2的载体，其中所述载体还包含5’NA导入序列.4.权利要求3的载体，其中所述.5’NA导入序列包括至少39个与NA3’ 39个编码核苷酸对应的核苷酸。5.权利要求1a)的载体，其中3’NA导入序列包括至少90个与NA起始90个编码核苷酸对应的核苷酸。6.权利要求1b)的载体，其中5’HA导入序列包括至少80个与HA3’ 80个编码核苷酸对应的核苷酸。7.权利要求1b)的载体，其中5’HA导入序列包括至少291个与HA3’ 291个编码核苷酸对应的核苷酸。8.权利要求1b)的载体，其中所述载体还包含3’HA导入序列。9.权利要求8的载体，其中3’HA导入序列包括至少3个与HA起始3个编码核苷酸对应的核苷酸。10.权利要求8的载体，其中3’HA导入序列包括至少9个与HA起始9个编码核苷酸对应的核苷酸。11.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段包含与内部核糖体入口序列对应的序列。12.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段包含与标记基因开放阅读框对应的序列。13.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段包含与病原体免疫原性蛋白或肽或治疗性蛋白的开放阅读框对应的序列。14.权利要求1的载体,其中所述导入序列来自于A型流感病毒。15.权利要求1的载体,其中所述导入序列来自于B型流感病毒。16.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：河冈义裕，
申请(专利权)人：威斯康星旧生研究基金会，
类型：发明
国别省市：