本发明专利技术提供了用于制备高度纯化的AAV载体制剂的方法。本文所述非常纯的AAV制剂对于临床用途较优。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产质量管理规范和病毒载体纯化的领域。更特别地，组合物和方法促进用于基因治疗方案的高度纯化的重组AAV的制备。
技术介绍
在本说明书各处引用若干出版物和专利文件以描述本专利技术所从属的领域的状态。这些引用各自通过引用如同全部陈述那样结合于本文中。基因递送是用于获得性疾病和遗传性疾病的治疗的充满前景的方法。已描述了用于基因转移目的的许多基于病毒的系统，包括基于腺相关病毒(AAV)的系统。AAV为属于依赖病毒属的依赖辅助病毒的DNA细小病毒。AAV需要与无关的辅助病毒(例如腺病毒、疱疫病毒或牛痘)共感染，以便发生生产性感染。在辅助病毒不存在的情况下，AAV通过将其基因组插入宿主细胞染色体中建立潜伏状态。通过辅助病毒的随后感染拯救整合的病毒基因组，其可接着复制以产生感染性的病毒子代。AAV具有广泛的宿主范围并且能够在存在合适的辅助病毒下在来自任何物种的细胞中复制。例如，人AAV在与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。AAV不与任何人或动物的疾病相关并且当整合时似乎并不改变宿主细胞的生物学性质。对于AAV的综述，参见例如 Berns 和 Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.)32:243-307。已描述了感染性重组AAV (rAAV)毒粒的构建。参见，例如，美国专利第5，173，414号和第5，139，941号；国际公布号WO 92/01070 (于1992年I月23日公布)和WO 93/03769(于 1993 年3 月 4 日公布)；Lebkowski 等· (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 ；Vincent 等.(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter,B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 ；Muzyczka, N. (1992)Current Topics in Microbiol, and Tmmunol · 158:97-129 和 Kotin, R. M. (1994)Human Gene Trephy 5:793-801。可改造AAV载体以通过全部或部分缺失AAV基因组的内在部分并将目标DNA序列插入ITR之间来携带异源的目标核苷酸序列(例如编码治疗蛋白的选定基因、反义核酸分子、核酶、miRNA等)。所述ITR在此类载体中仍有功能，允许包含异源的目标核苷酸序列的rAAV的复制和包装。所述异源的核苷酸序列还典型地与能够在某些条件下在患者的靶细胞中驱动基因表达的启动子序列连接。终止信号，例如聚腺苷酸化位点，也可包含于所述载体中。虽然完全消除病毒载体的免疫原性并非现实的目标，但将制备用于人基因治疗的AAV载体的免疫原性最小化是高度所需的。本专利技术的一个目标是提供实现该目标的组合物和方法。专利技术简述 依照本专利技术，提供了用于从包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质的AAV制备物中纯化包含编码治疗蛋白或其片段的转基因的真正的AAV载体颗粒，从而提供基本不含AAV空衣壳的AAV产物的方法。示例性纯化方案包括收获转导了 AAV的细胞；经由切向流过滤浓缩所述细胞；以及通过微射流裂解所述细胞以形成裂解液。接着将裂解液过滤并澄清。澄清后，AAV颗粒通过离子交换柱层析法纯化并任选通过切向流过滤进一步浓缩。接着将如 此产生的洗脱液在等密度梯度上分层并进行超速离心，收获包含病毒颗粒的层并通过切向流过滤进行缓冲液交换。接着纯化的AAV颗粒用表面活性剂配制，并将所得制剂过滤以移除任何残留杂质，从而产生高度纯化的AAV产物，其中所述真正的AAV载体颗粒在所述AAV产物中以至少95%的量，优选大于98%的量存在。在一个优选的实施方案中，AAV产物包含IO15个颗粒/mL浓度的AAV颗粒，更优选颗粒以IO16个颗粒/mL浓度存在并且最优选，颗粒以IO17个颗粒/mL浓度存在。如此纯化的AAV载体可为多种血清型的，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。在又一个实施方案中，公开了一种AAV载体制剂，其在药学上可接受的载体中包含使用上述方法纯化的AAV颗粒。本专利技术的纯化的AAV颗粒包含编码所需基因产物的异源核酸。此类产物包括但不限于SiRNA、反义分子、miRNA、核酶等。其它产物包括编码可用于修正先天性代谢缺陷的激素、生长受体、配体和蛋白的核酸。在特别优选的实施方案中，载体编码选自RPE65、因子VIII和因子IX的蛋白。附图简述 图I.重组AAV产生期间产生的AAV颗粒的类型的图解，包括使用当前工业标准的可扩缩纯化工艺达到的纯化(真正的载体和载体相关杂质的混合物)，和使用我们的可扩缩纯化方法达到的纯化(载体相关杂质的基本移除)的示意图，我们的可扩缩纯化方法掺有梯度超速离心步骤，根据所用纯化步骤的顺序使所述梯度超速离心步骤“可扩缩”。图2.显示本专利技术的载体纯化工艺步骤的流程图。图3.通过梯度超速离心的代表性工业标准可扩缩纯化工艺(genl-Chr)-纯化的AAV载体的分析。显示了表面上‘纯的’载体中的AAV颗粒的相对量和异质性，以及在真正的AAV载体自载体相关杂质的分离中梯度超速离心的有效性。‘genl-Chr’代表了当前“工业标准”可扩缩纯化工艺。专利技术详述 本专利技术提供了一种AAV载体纯化平台，其包含两个将其与当前‘工业标准’的可扩缩AAV载体纯化工艺区别的独特特征1)提供高的载体纯度的可用于不同AAV血清型/衣壳变体的纯化的模块化平台方法，所述方法包括载体相关杂质的有效移除；和2)方法步骤的独特顺序(包括柱层析法、之后的切向流过滤和接着的梯度超速离心的关键‘核心’顺序)，其赋予对重要的超速离心步骤的意外的可扩缩性。AAV载体产生和纯化方法的最优化确保了载体产物可有效地将其遗传有效负载递送至靶细胞，并使有害的免疫应答的激活的可能性最小化。由于载体相关杂质对于预期的人受者是非自身且免疫刺激的，其应在人胃肠外产品的纯化期间最小化或消除。载体相关杂质在细胞培养中的载体产生期间典型地以比真正的载体高得多的量产生，并且由于它们结构相似在纯化期间难以与载体分离。在载体产生后的粗制细胞收获物中，载体相关杂质通常占>50%，典型地约80%，并且可占生物合成的总AAV颗粒的>80%。这在使用迄今为止开发用于产生AAV载体的各细胞培养系统中已观察到。纯化作为治疗人类疾病的产品的重组AAV的生产方法的开发必须实现以下目标I) 一致的载体纯度、效价和安全性；2)生产方法的可扩缩性；和3)生产的可接受成本。当前‘工业标准’的可扩缩AAV载体纯化工艺并不足以实现载体相关杂质的移除，其对于满足以上列出的第一目标(一致的载体纯度、效价和安全性)是重要的。此外，已出现使用当前工业标准的可扩缩纯化工艺不能充分地移除载体相关杂质的情况，这是由于1)用于除疫苗(其中通常寻求而非避免免疫应答)之外的应用的病毒产物(例如重组AAV)的纯化工艺的开发是相对不成熟的；2)涉及用于AAV载体的可扩缩纯化工艺的开发的许多本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.28 US 61/299,1841.一种用于从包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质的AAV制备物中纯化包含编码治疗蛋白或其片段的转基因的真正的AAV载体颗粒，从而提供基本不含AAV空衣壳的AAV产物的方法，所述方法包括 a)收获包含重组AAV的细胞； b)经由切向流过滤浓缩所述细胞； c)通过微射流裂解所述细胞以形成裂解液； d)过滤，从而使步骤c)的裂解液澄清； e)通过离子交换柱层析法纯化AAV颗粒并任选通过切向流过滤浓缩柱洗脱液； f)混合所述洗脱液和氯化铯并将所述混合物进行离心； g)在步骤f)之后收集病毒颗粒并通过切向流过滤进行相同的缓冲液交换； h)用表面活性剂配制纯化的AAV颗粒以提供AAV颗粒制剂； i)过滤所述制剂以移除任何残留的杂质，其中所述AAV产物中存在的所述真正的AAV载体颗粒的量为至少95%。2.权利要求I的方法，其中所述AAV载体颗粒以100mg/mL的浓度存在。3.权利要求I的方法，其中步骤i)的所述AAV颗粒以IO15个颗粒/mL的浓度存在。4.权利要求I的方法，其中步骤i)的所述AAV颗粒以IO16个颗粒/mL的浓度存在。5.权利要求I的方法，其中步骤i)的所述AAV颗粒以IO17个颗粒/mL的浓度存在。6.权利要求I的方法，其中所述AAV载体颗粒来源于选自以下的AAVAAVU AAV2、AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。7.—种AAV载体制剂，其在药学上可接受的载体中包含使用权利要求I的方法纯化的AAV颗粒。8.权利要求I的方法，其中所述转基因编码选自以下的核酸SiRNA、反义分子、miRNA、核酶和 shRNA。9.权利要求I的方法，其中所述转基因编码选自以下的基因产物胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、制管张素、粒细胞集落刺激...
【专利技术属性】
技术研发人员：JF赖特，G屈，B豪克，K海，
申请(专利权)人：费城儿童医院，
类型：
国别省市：
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