重组病毒载体的结构及其制备制造技术

本专利为一种生产复制缺陷型重组病毒载体的方法，复制缺陷型重组病毒载体含有一个或多个病毒基因缺陷，该方法包括：使用含有可编码一或数个反式因子或其变体的病毒基因组的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组病毒载体，携带病毒为细胞质病毒，其有把其基因组保留在宿主细胞的细胞质中能力，宿主细胞含有重组病毒基因组并能将其保留与宿主细胞的细胞核内，本专利同时也提供一种生产复制缺陷型重组病毒载体的的携带病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及病毒学和分子生物学，尤其是重组病毒载体生产的构成配方及方法。
技术介绍
搭载有外源基因的重组病毒载体可用于将外源基因导入到细胞内。在细胞内，夕卜源基因可进行表达从而产生多聚肽或多聚核酸(例如miRNA、RNAi、反义RNA)进而治疗或改善人或其他哺乳动物的遗传缺陷疾病。外源基因的插入同时可用于DNA重组和基因的修复，在这种情况下，外源基因的沉默是必要条件。 用于外源基因转运的重组病毒载体通常缺少病毒复制所需的一个或数个基因，这样，在接受治疗的病人体内，重组病毒载体并不能进行自我复制增殖。在重组病毒的生产构建过程中，这些所缺失的基因通过互补的方式从非重组病毒的外源性DNA序列获得补充，从而使重组病毒能够进行复制和包装。但是，由于这些外源性DNA序列和重组病毒基因组同时存在于宿主细胞的细胞核内，这些DNA序列和重组病毒基因之间的能够发生重组反应，可能导致产生在临床治疗过程中所不愿见到的具有完整复制活性的病毒。因此，一个既生产不被具有复制活性的完整病毒污染，同时又易于工业化生产的重组病毒载体制备方法就显得十分必要。专利技术概述本专利技术主要涉及一种在生产复制缺陷型重组病毒载体过程中清除或减少具有完整复制活性病毒的新方法。复制缺陷型重组病毒载体通常含有一个或数个病毒基因缺失。该方法步骤包括使用含有编码一个或数个复制缺陷型病毒载体反式因子或其变体的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组病毒载体。该携带病毒为任何一种细胞质病毒。因为是细胞质病毒，所以携带病毒能使其基因组保存在宿主细胞的细胞质中。携带病毒上所编码的一个或多个重组病毒反式因子能补偿重组病毒复制和包装所缺失的一个或多个基因的功能。携带病毒上所编码的一个或多个重组病毒反式因子也包含复制缺陷型重组病毒的结构蛋白。整个重组病毒的DNA则在宿主细胞里面并保留在宿主细胞的细胞核内。本专利技术同时介绍一种生产具有一个或多个基因缺陷的复制缺陷型重组病毒载体的方法。该方法步骤包括使用含有编码一个或数个复制缺陷型重组病毒的反式因子或其变体的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组病毒载体。携带病毒为任何细胞质病毒。携带病毒能把病毒载体的反式因子基因组保留在宿主细胞的细胞质中。其病毒载体的基因组能补偿重组病毒复制和包装所缺失的一个或多个基因的功能，其反式因子包含有复制缺陷型重组病毒中的结构蛋白。宿主细胞则含有整个重组病毒基因组并将其保留在宿主细胞的细胞核内。复制缺陷型重组病毒载体包括选自腺病毒科、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科的重组病毒载体以及重组微小病毒载体中的任何一种。本专利技术同时介绍一种复制缺陷型重组AAV载体的生产制备方法。重组AAV病毒载体缺失衣壳蛋白的基因组。该方法步骤包括使用含有编码一个或数个AAV反式因子或其变体的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组AAV载体。携带病毒为任何细胞质病毒，携带病毒有二个至多个AAV衣壳蛋白基因编码，能在宿主的细胞质中合适比例表达这些蛋白，一促进复制缺陷型AAV载体复制和包装。宿主细胞则含有重组AAV基因组并将其保留在宿主细胞的细胞核内。本专利技术同时介绍携带病毒。携带病毒由衣壳蛋白和携带病毒基因组组成。携带病毒基因组由细胞质病毒的DNA序列以及编码二个至多个AAV结构蛋白或其变体的DNA序列组成。衣壳蛋白和来自细胞质病毒的DNA序列使其进入宿主细胞后能在细胞质中稳定存在。携带病毒病毒基因组能以合适的比例表达二个至多个AAV结构蛋白，进而以促进缺少二个至多个AAV结构蛋白的重组AAV载体生产。附图说明·图I-为现有(以前)生产重组病毒载体示意图。RCV是“有自复制能力病毒”图2-为通过分隔反式元件和顺式元件到不同的细胞部位，得以生产无“具有复制活性病毒“(RCV)的重组病毒载体的方法示意图。图3-为使用痘苗病毒作为反式元件携带病毒以生产重组AAV载体的的示意图。图4-为使用痘苗病毒作为反式元件携带病毒以生产重组腺病毒载体的的示意图。图5-为使用痘苗病毒作为反式元件携带病毒以生产高容量腺病毒载体的的示意图。图6-为使用VSV病毒作为反式元件携带病毒以生产重组AAV载体的的示意图。图7-为穿梭质粒plasmid pRB21的图谱。图8-为穿梭质粒pRB-repcap的图谱。图9-为构建vvAAV-Hl的示意图。图10-为使用特异性针对VP1、VP2和VP3的抗体，即在Hela细胞中表达的vvAAVvpl、vvAAVvp2 以及 vvAAVvp3 所做的 Western 印迹分析图。图11-为AAV生产例子中Rep和Cap表达的特征的简图。如图所示，首先vAd-AAVITR-CMV-GFP 以 M0I=2 感染 Hela 细胞，随后 5 种 rWs (vvAVr印78、vvAAVr印52、vvAAVvpl、vvAAVvp2、vvAAVv3)分别在不同的时间点以MOI=I感染Hela细胞,rVVs转导48h后收集Hela细胞。图示为收获的细胞裂解物中cap和rep的western印迹。
技术实现思路
除非另有说明，本专利技术中所使用的技术及科学术语与本专业通常所理解相同。所有引用的文献与其报道操作相同。本专利技术所使用的操作，除特别说明外，一般为化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、基因工程、病毒学以及免疫学常用技术，例如=SambiOok等，2000 ； Molecular Cloning: A Laboratory Manual (《分子克隆-实验操作手册》)，Harlow 等。“重组病毒载体”或“重组病毒”是通过重组DNA技术所产生的病毒。重组病毒缺乏病毒复制所需的一个或多个基因，因此为复制缺陷型(例如，重组病毒在接受其治疗的病人体内无法进行自我复制)。“重组病毒基因组”或“顺式元件”为重组病毒所包含的基因信息。重组病毒基因组可能含有所有或部分的病毒基因组。而病毒基因组可能是野生型，也可能存在点突变、插入或删除。在重组病毒基因组中，表达控制序列可能选择性地联锁有转基因。转基因两侧可能有侧翼元件。本专利技术中的重组病毒基因组可能会整合到宿主的染色体上，或通过物理的或化学的方式转染到宿主核酸上，或通过病毒载体靶向进入到宿主细胞核内，并最终包装进入重组病毒载体内。“侧翼元件”或“侧翼核酸”通常为来自哺乳动物病毒的核酸序列。当其存在于转基因的侧翼时，转基因将被包裹进重组的病毒载体内。侧翼元件可能为来自天然的哺乳动物病毒，也可能为人工的核酸序列，如具有相同或相似核酸蛋白功能的突变序列。广义上讲，侧翼元件包括来自腺伴随病毒(AAV)或腺病毒(Ad)的末端反向重复序列(ITRs)、来自反 转录病毒长末端重复序列(LTRs)、来自单纯疱疹病毒(HSV)的“a”或包装序列以及来自其他已知病毒中复制核酸包被的任何其他序列。“转基因”为运入或转入哺乳动物细胞的核酸序列。转基因可能编码作为标记分子、报道分子或治疗分子的蛋白、肽或多肽。转基因同时也编码有利于蛋白保护、诊断分析或体内体外任何短暂或稳定基因转移的蛋白、肽或多肽。此外，转基因也可能编码功能性多聚核酸，如miRNA、RNAi、反义RNA、核酶或其他调控核酸。转基因同时也包括用于诱导DNA重组和基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫东，
申请(专利权)人：肖卫东，
类型：
国别省市：