日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由含日本血吸虫C1qBP基因的重组载体经表达而制得。本发明专利技术还公开了该日本血吸虫重组蛋白rSjC1qBP的制备方法及其在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。本发明专利技术的日本血吸虫重组蛋白rSjC1qBP，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG抗体并能达到一个较高水平，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病新药物的潜力，具有很好的应用价值。本发明专利技术的重组蛋白rSjC1qBP能够抑制补体溶血，溶血抑制率达30％以上，表明本发明专利技术重组蛋白rSjC1qBP具有与补体系统C1q分子结合的能力，对于治疗补体活性异常疾病的应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。日本血吸虫唯一的中间宿主钉螺分布面积广、孳生环境复杂，难以消灭；再者，人畜重复感染严重。因此，我国的日本血吸虫病防治工作仍然是一项长期、艰巨而复杂的任务。血吸虫尾蚴钻入终末宿主皮肤转变为童虫，移行经过肺脏、肝脏后发育为成虫，并在宿主体内繁殖产卵、长期寄生。血吸虫寄居的血液环境为其提供了适宜的生理生化环境及营养、激素、信号分子等物质，但也使它直接暴露于宿主的免疫效应因子中，如宿主补体。补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，其作用的发挥依赖补体系统的激活。补体系统可迅速标记并清除入侵微生物或毒性成分，介导体液免疫和细胞免疫，是机体中重要的免疫调节和效应放大系统。血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后就受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开始杀伤虫体的免疫应答，是宿主获得非特异性抗力的机理之一。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体系统的适应性，相当比例的血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在已建立免疫应答的宿主血管内存活、发育成熟并繁殖产卵，对补体反应的调节是其免疫逃避策略的重要组成部分。C1q作为补体经典途径的起始分子，是补体系统经典途径的重要识别分子，能够启动经典途径，并且在固有免疫和特异性免疫之间发挥主要的连接作用。C1qBP能够与C1q结合，抑制补体激活途径。研究SjC1qBP有助于解释血吸虫免疫逃避现象，揭示虫体与宿主之间相互作用，评估C1qBP分子作为抗血吸虫新药物的潜力，并为筛选抗血吸虫新药物分子提供依据。但是，到目前为止，还没有出现关于日本血吸虫SjC1qBP重组蛋白作为抗血吸虫药物的公开报道。补体(complement,C)是机体固有免疫(innateimmunity)的重要效应系统，因为是最初发现于血清中的不耐热蛋白，可辅助或“补充”特异性抗体的杀菌作用而得名。作为体内最复杂的限制性蛋白水解系统，补体位于机体防御的一线。补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分。补体级联反应的激活包括三条途径，分别为经典途径、替代途径和凝集素途径。经典途径在特异性免疫的效应阶段发挥作用；替代途径和旁路途径参与非特异性免疫，在感染早期抵抗病原微生物感染中发挥重要作用。补体反应是非常迅速、级联放大的免疫防御机制，是宿主杀伤血液内寄生虫的重要途径。研究表明，补体反应是宿主杀伤克氏锥虫的重要效应机制。血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后就受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开始杀伤虫体的免疫应答，是宿主获得性非特异性抗力的机理之一。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体系统的适应性，对补体反应的调节是其免疫逃避策略的重要组成部分。血吸虫在尾蚴阶段对血清补体非常敏感，但在尾蚴转变为童虫2-4小时后对血清补体杀伤的敏感性就开始逐渐下降，这表明血吸虫在感染初期就对宿主补体反应有调节作用。
技术实现思路
本专利技术要解决目前缺乏抗血吸虫新药物的技术问题，提供一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白包含日本血吸虫C1qBP(SjC1qBP)的SEQIDNO.1所示氨基酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病新药物。此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫C1qBP基因，该基因序列是编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，所述基因序列是SEQIDNO.2所示核苷酸序列。更优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET-32a(+)，所述日本血吸虫C1qBP基因插入在空载体pET-32a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点之间。在本专利技术的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。本专利技术的日本血吸虫重组蛋白，还包含由部分载体序列表达的具有His、Trx等标签序列，该标签序列仅是便于后续的重组蛋白的纯化。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含日本血吸虫C1qBP基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫C1qBP蛋白。优选的，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫C1qBP蛋白进一步纯化。在本专利技术的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫C1qBP基因的重组表达载体，具体包括以下步骤：利用生物信息学进行在线分析，找出编码日本血吸虫C1qBP的核苷酸片段；根据该核酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增核酸片断，再利用特异限制性内切酶EcoRⅠ、XhoI将编码SjC1qBP抗原的核酸片段定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组蛋白的补体抑制剂，该补体抑制剂可应用于生物学实验。在本专利技术的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组蛋白特异性结合的抗体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白在制备治疗血吸虫病药物中的应用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白在制备治疗补体异常疾病的药物中的应用。本专利技术日本血吸虫重组蛋白，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG抗体并且能达到一个较高水平，Western-blot分析表明rSjC1qBP具有较好的免疫原性，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病新药物的潜力，具有很好的应用价值。且本专利技术的重组蛋白rSjC1qBP能够抑制补体溶血，产生的溶血抑制率可达30％以上，表明本专利技术重组蛋白rSjC1qBP具有与补体系统C1q分子结合的能力，对于治疗补体活性异常疾病的应用前景非常广阔。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的SjC1qBP的PCR扩增结果及重组原核表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP的双酶切鉴定图；图2是本专利技术实施例1重组蛋白SjC1qBP表达时相分析图；图3是本专利技术实施例1重组蛋白SjC1qBP表达及纯化结果图；图4是本专利技术实施例2重组蛋白SjC1qBP抗原性分析结果图；图5是本专利技术实施例3抗rSjC1qBP特异性IgG抗体水平的检测结果图；图6是本专利技术实施例4溶血试验的结果图；图7是本专利技术实施例4补体结合试验结果图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。本专利技术利用PCR克隆了日本血吸虫SjC1qBP(简称SjC1BP)基因编码序列，并且进行了生物信息学分析，SjC1BPORF含729个核苷酸，编码242个氨基酸，理论分子量为27.58k本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫C1qBP基因，该基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫C1qBP基因，该基因序列是编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述基因序列是SEQIDNO.2所示核苷酸序列。3.一种包含权利要求1或2所述重组载体的宿主细胞。4.一种日本血吸虫重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求1所述重组载体经表达而制得。5.一种日本血吸虫重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建含日本血吸虫C1qBP基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅志强，贾秉光，马帅，宰金丽，柴淑梅，吕超，韩倩，张祖航，陆珂，洪炀，李浩，林矫矫，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31