一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的重组牛乳铁蛋白肽衍生肽抑菌活性显著优于牛乳铁蛋白肽母肽，尤其对葡萄球菌具有良好的抑制效果，市场前景好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽及其制备方法和用途。
技术介绍
牛乳铁蛋白肽(LfcinB)是位于牛乳铁蛋白(LfB)N-末端长度为25个氨基酸残基的阳离子抗菌肽(氨基酸序列为：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF)，由胃蛋白酶降解产生，具有多种生理功能，如广谱抗菌性、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等，而且LfcinB不易产生抗药性，在食品，药品，动物饲料等领域有着广阔的应用前景。从20世纪80、90年代至今，牛乳铁蛋白肽一直是研究者们关注的热点，研究者试图通过提高LfcinB的抑菌活性，以得到新型的抗生素替代物。采用的手段多是将LfcinB异源表达以提高其活性。另外也有对LfcinB进行结构优化以获得活性更好的LfcinB衍生肽的研究，只是由于任何一个氨基酸的替换都可能会改变LfcinB肽链的空间结构，从而改变其性质，甚至降低其活性。如何通过结构改造得到具有高抑菌活性的LfcinB衍生肽是目前急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)及其制备方法和用途。本专利技术提供了一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽，它的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。SEQIDNO：1牛乳铁蛋白肽衍生肽的氨基酸序列，序列为：FKCRRWQWRWKKLGAPSITCVRRAF。本专利技术还提供了一种牛乳铁蛋白肽衍生肽的核苷酸序列，它编码SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。其中，它的序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：2牛乳铁蛋白肽衍生肽的核苷酸序列，序列为：TTCAAGTGCAGAAGATGGCAGTGGAGATGGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATCACCTGCGTTAGAAGAGCTTTC。本专利技术还提供了一种重组载体，它包含上述核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pPIC9K质粒。本专利技术还提供了一种重组菌，它包含上述重组载体。其中，所述的重组菌是重组酵母菌；优选地，所述重组酵母菌为重组毕赤酵母菌GS115。本专利技术还提供了一种制备上述重组牛乳铁蛋白肽衍生肽的方法，包含如下步骤：a、取上述重组菌，接种到BMGY培养基上，30℃，200r/min振荡培养至OD600为2.5时，离心，取沉淀；b、在步骤a的沉淀中加入BMGY培养基，重悬，加入甲醇，并保持培养基中甲醇终浓度为0.5-2％(V/V)，诱导培养72小时；c、离心，收集上清液，分离纯化，即可。本专利技术还提供了上述重组牛乳铁蛋白肽衍生肽在制备抑菌剂中的用途。其中，所述抑菌剂为抑制葡萄球菌的制剂；进一步地，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。本专利技术利用生物信息学工具、抗菌肽数据库及蛋白分析软件等对LfcinBD进行结构优化设计，并根据毕赤酵母偏爱密码子特性合成新的抗菌肽LfcinBD基因序列，该序列被克隆至真核表达载体pPIC9K构建重组质粒，电转化毕赤酵母GS115中表达，筛选得到含有LfcinBD基因的阳性毕赤酵母菌，优化阳性转化子发酵条件，获得该衍生肽的高效表达。本专利技术经过优化改造得到的重组牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)在毕赤酵母中能够有效表达，经过分离纯化的发酵上清液对金黄色葡萄球菌有很强的抑菌作用，抑菌活性显著优于同等发酵条件下的牛乳铁蛋白肽母肽，市场前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽LfcinBD基因合成序列图。图2为质粒载体pPIC9K物理图谱。图3为抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽LfcinBD酵母重组表达载体的构建流程图。图4为重组质粒载体pPIC9K-LfcinBD的PCR鉴定，图中：M为DNAMarker；1、2为以空质粒载体pPIC9K为模板的扩增产物；3、4为pPIC9K-LfcinBD重组载体的扩增产物。图5为重组酵母转化子基因组的PCR鉴定，M为DNAMarker；1为空酵母菌株GS115基因组PCR扩增产物，2为转化空质粒pPIC9K的酵母基因组PCR扩增产物，3-12为重组酵母菌株的基因组PCR扩增产物。图6为抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽LfcinBD对金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果，图中：图中心阳性对照为10μL100mg/mL氨苄青霉素Amp的抑菌活性；编号29、30为阴性对照，GS115空菌株发酵上清液的抑菌活性，其余编号均为阳性毕赤酵母工程菌株诱导72h后，发酵上清液中表达的牛乳铁蛋白肽衍生肽的抑菌活性。图7为抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽LfcinBD的SDS-PAGE检测结果。图中：M为蛋白Marker；1为LfcinB发酵上清液；2为LfcinBD发酵上清液。图8为抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽LfcinBD与母肽牛乳铁蛋白肽LfcinB对金黄色葡萄球菌的抑菌活性对比结果，图中：1、2为LfcinB发酵上清液的抑菌活性，3、4为LfcinBD发酵上清液的抑菌活性。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。本专利技术所用的实验试剂如下：PlasmidMidiKit购自QIAGEN；DNAPurificationKit购自Invitrogen；TIANampYeastDNAKit酵母基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN；氨苄青霉素、LB培养基、琼脂糖、EcoRI及NotI限制性内切酶、10XBuffer、TangoTM,6XDNALoadingBuffer,100bP及1kbpDNALadder,ddwater,SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、、SanPrep柱式质粒DNA抽提试剂盒，EcoRI和NotI限制性内切酶；T4DNA连接酶；2XTaqPCRbuffer；质粒载体pPIC9K；氨节青霉素Amp、Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒，生物素(Biotin)、2XTaqPCRMasterMix(PCR反应试剂)、SacI限制性内切酶购自生工(上海)生物有限公司；无氨基酵母氮源(YNB)购自北京拜尔迪生物公司；酵母膏(Yeastextract)、蛋白胨(CPeptone)购自OXOID公司；葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、山梨糖醇,琼脂粉、甲醇、75％乙醇，冰醋酸等生化试剂购自华东化玻有限公司。实验设备如下：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ系列)恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司，QYC200型)不锈钢压力蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司，手提式)PH计(上海梅特勒一托利多仪器有限公司，FE-200系列)磁力搅拌器(上海三申医疗器械有限公司，YX208A系列)霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，BPMJ-250E系列)恒温水浴培养箱(太仓市强乐实验设备有限公司，LSHZ-300系列)小型高速离心机(德国Eppendorf产品有限公司，Eppendorf54188型)DNA水平电泳仪(Bio-Rad生命医学产品有限公司，1645050型)蛋白垂直电泳仪(Bio本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组牛乳铁蛋白肽衍生肽，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种牛乳铁蛋白肽衍生肽的核苷酸序列，其特征在于：它编码SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：它的序列如SEQIDNO：2所示。4.一种重组载体，其特征在于：它包含权利要求2或3所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pPIC9K质粒。6.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求4或5所述的重组载体。7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌是重组酵母菌；优选地，所述重组酵母菌为重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕自力，王亮，郭爱珍，单旭东，刘小章，
申请(专利权)人：成都中医药大学，
类型：发明
国别省市：四川;51