一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备及其应用，含以下步骤：将含有石斑鱼神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的重组载体pET32a‑NNV转化到大肠杆菌BL21，诱导融合基因进行表达；将表达后的NNV衣壳蛋白包涵体进行纯化；将纯化后的NNV衣壳蛋白添加到黄粉虫饲料中，将虫体培养至特定阶段，冷冻干燥并碾磨成粉末；用虫体粉末喂食石斑鱼，使石斑鱼免疫神经坏死病毒。本发明专利技术提供的方法可以使用大肠杆菌大量表达NNV衣壳蛋白；食用了NNV衣壳蛋白的黄粉虫体粉能有效提高石斑鱼对神经坏死病的免疫力。

Preparation method and application of grouper nervous necrosis virus capsid protein

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a grouper nervous necrosis virus capsid protein preparation and application, including the following steps: containing grouper nervous necrosis virus (NNV) recombinant vector pET32a NNV capsid protein gene transformed into Escherichia coli BL21 induced fusion gene expression of NNV capsid protein inclusion; expression of purified; adding the purified NNV capsid protein to feed the larvae of Tenebrio molitor, to develop specific stage, freeze-dried and milled into powder; with insect powder feeding grouper, the grouper nervous necrosis virus immune. The method provided by the invention can use a large number of Escherichia coli expressing NNV capsid protein; edible Tenebrio molitor powder can effectively improve the NNV capsid protein of grouper nervous necrosis disease.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法。
技术介绍
石斑鱼是一种重要的经济鱼类，尤其是在亚洲。神经坏死病毒(NNV)可攻击石斑鱼的神经系统，造成致命性的病毒脑病和视网膜病变。NNV一旦爆发会造成仔、稚鱼的大量死亡，发病后死亡率高达80-100％，带来巨大的经济损失，成为限制石斑鱼养殖业发展的主要瓶颈。石斑鱼神经坏死病毒(NNV)属于Betanodaviridae病毒属Betanodavirus科，能在许多鱼类中传播。鱼类患病后出现神经紊乱症状，中枢神经系统和视网膜有局部空泡，并伴有螺旋式游泳，鱼鳔控制异常等表现。至今已从14个科30种以上的海洋鱼类体内分离出NNV。NNV基因组包含两条正义RNA连，其中RNA1编码一个RNA依赖的RNA聚合酶，RNA2编码病毒衣壳蛋白。在NNV基因所编码的蛋白中，衣壳蛋白具有免疫活性，可被用于制作疫苗。利用基因工程技术可在大肠杆菌中高效表达病毒衣壳蛋白，然而，由于原核细胞结构简单，通常在大量表达的同时不能使NNV衣壳蛋白正确折叠，最终呈包涵体形式存在，成为NNV疫苗开发的一大障碍。克服这一问题是当前石斑鱼神经坏死病的免疫防治迫切需求。
技术实现思路
一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，其特征在于，包含以下步骤：(1)将含有斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因的重组质粒pET32a-NNV转化到大肠杆菌BL21中，37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为1mM，降温至25℃，诱导表达12h；(2)诱导表达完成后离心收集菌体，破碎，对包涵体进行纯化，将纯化后的包涵体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛。进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白大小为37kDa。进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列为SeqIDNo1。进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白序列为SeqIDNo2。进一步的，所述步骤(2)中离心是在10000rpm转速下离心20min，弃上清。进一步的，所述步骤(2)中破碎是将收集的菌体用裂解液重悬后采用高压均质机破碎，每次破碎压力为1000bar，时间为10min，共破碎3次。进一步的，所述裂解液组成为：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl、125mM咪唑。进一步的，所述步骤(2)中，石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白包涵体纯化步骤为：(1)取破碎后的菌体在20000rpm条件下离心30min后弃去上清，沉淀加入缓冲液B1，混匀后25℃振荡30min；(2)20000rpm离心30min后弃去上清，加入缓冲液B2，混匀后25℃振荡30min；(3)20000rpm离心30min后弃去上清，加入纯水，混匀后25℃振荡30min；(4)重复步骤(3)两次；(5)20000rpm离心30min后弃去上清，沉淀冷冻干燥后碾磨成粉末。进一步的，所述缓冲液B1组成为：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl、1％TritonX-100；缓冲液B2组成为：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl。更进一步的，衣壳蛋白的应用方法，将所述衣壳蛋白粉末添加到饲料中，喂食3龄期黄粉虫，培养至4龄期时，将虫体冷冻干燥并碾磨成粉末，并过80目筛，即得抗神经坏死病毒天然药剂。更进一步的，所述抗神经坏死病毒天然药剂的应用方法为，将衣壳蛋白粉末按黄粉虫平均体重的1％添加到饲料中。。特别的，本专利技术基于GenBank已公布的NNV衣壳蛋白基因序列(SeqIDNo3)，人工合成基因并构建重组载体，其所含NNV衣壳蛋白基因序列为SeqIDNo1，第42-54个碱基由原始的accaaggccgcg变为cgcggg，导致对应的蛋白序列N端15-18个残基由TKAA变为RG(见SeqIDNo2)。实验表明，相比于重组入原始SeqIDNo3序列，含SeqIDNo1的菌株蛋白表达量由23mg/g菌体(湿重)增加至27mg/g菌体(湿重)，提高达17.4％与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术制备的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白表达高效稳定。经病毒细胞对抗体敏感性检测证实，本专利技术所制备的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白能够有效抑制石斑鱼神似坏死病，效价高，具有良好的免疫保护效力，可以在鱼类的稚鱼期，将其作为抗神经坏死病毒疫苗添加到鱼类饲料中，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广提供了可能性，具有广阔的市场前景。附图说明：图1：免疫效力检测。序列表说明：SeqIDNo1为本专利技术菌株所带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因对应的核苷酸序列。SeqIDNo2为本专利技术菌株所带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因对应的氨基酸序列。SeqIDNo3为GenBank已公布的一段石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因。为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。具体实施方式：下面结合实施例对本专利技术作进一步说明：实例1：石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白诱导表达及纯化将含目的基因的大肠杆菌在37℃、250rpm培养至OD0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，并使培养温度将至25℃。培养12h后结束表达。10000rpm转速下离心20min，充分弃去上清。按3mL/g菌体(湿重)加入裂解液重悬菌体，随后采用高压均质机破碎，压力1000bar。破碎后的菌体在20000rpm下离心30min后弃去上清，按2mL/g菌体(湿重)加入缓冲液B1，混匀后25℃振荡30min；(2)20000rpm离心30min后弃去上清，按2mL/g菌体(湿重)加入缓冲液B2，混匀后25℃振荡30min；(3)20000rpm离心30min后弃去上清，按2mL/g菌体(湿重)加入纯水，混匀后25℃振荡30min；(4)重复(3)两次；(5)20000rpm离心30min后弃去上清。其中，裂解液组成包括：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl、125mM咪唑；缓冲液B1组成包括：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl、1％TritonX-100；缓冲液B2组成包括：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl。所得沉淀在-80℃冷冻后，置于预冷好的冷冻机内冷冻干燥，最后碾磨成粉末，并过80目筛。实例2：重组NNV衣壳蛋白应用于石斑鱼神经坏死病防治选取3龄期黄粉虫，按体重1％将NNV衣壳蛋白粉末添加于饲料中喂食。虫体培养至4龄期后，-80℃冷冻凝固，然后置于预冷好的冷冻机内冷冻干燥，最后碾磨成粉末，并过80目筛。将虫粉末按鱼体重1.5％添加到鱼饲料中喂食石斑鱼，每周喂食1次虫粉末，共喂食3次。最终提高石斑鱼对NNV的免疫力。实施例3：免疫效力检测免疫组1：取实施例2中免疫的石斑鱼。免疫组2：采用目前已公布NNV衣壳蛋白制备方法制备的衣壳蛋白粉末喂养3龄期黄粉虫，虫体培养至4龄期后，-80℃冷冻凝固，然后置于预冷好的冷冻机内冷冻干燥，最后碾磨成粉末，并过80目筛。将虫粉末按鱼体重1.5％添加到鱼饲料中喂食石斑鱼，每周喂食1次虫粉末，共喂食3次。其中，已公布的NNV衣壳蛋白制备方法为：在原核条件下，培养已含有编码神经坏死病毒衣壳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，其特征在于，包含以下步骤：(1)将含有石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因的重组质粒pET32a‑NNV转化到大肠杆菌BL21中，37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为1mM，降温至25℃，诱导表达12h；(2)诱导表达完成后离心收集菌体，破碎，对包涵体进行纯化，将纯化后的包涵体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛。

【技术特征摘要】
1.一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，其特征在于，包含以下步骤：(1)将含有石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因的重组质粒pET32a-NNV转化到大肠杆菌BL21中，37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为1mM，降温至25℃，诱导表达12h；(2)诱导表达完成后离心收集菌体，破碎，对包涵体进行纯化，将纯化后的包涵体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白大小为37kDa。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所表达石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列为SeqIDNo1。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所表达石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白序列为SeqIDNo2。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中离心是在10000rpm转速下离心20min，弃上清。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中破碎是将收集的菌体用裂解液重悬后采用高压均质机破碎，每次破碎压力为1000bar，时间为10min，共破碎3次；其中，所述裂解液组成为：10mMTris-HCl(pH7.1)、100mMNaCl、125mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁于人，殷波，陆洲，
申请(专利权)人：斯澳生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32