用于制备EV71病毒样颗粒的核酸构建体和方法技术

本发明专利技术属于分子生物学、病毒学和免疫学领域，涉及一种用于制备EV71病毒样颗粒的核酸构建体和方法。本发明专利技术还涉及包含所述核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。本发明专利技术还涉及一种串联共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的方法以及纯化方法、一种制备EV71病毒的病毒样颗粒的方法等。进一步地，本发明专利技术还涉及一种EV71病毒样颗粒以及含有它的药物组合物例如疫苗。本发明专利技术实现了人手足口病病毒(EV71)衣壳蛋白在大肠杆菌中可溶共表达，并且表达量较高，最终获得的目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的10％，其组成的EV71病毒样颗粒与天然的EV71病毒构象高度接近。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、病毒学和免疫学领域，涉及一种用于制备EV71病毒样颗粒的核酸构建体和方法。本专利技术还涉及包含所述核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。本专利技术还涉及一种串联共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的方法以及纯化方法、一种制备EV71病毒的病毒样颗粒的方法、以及一种制备手足口病疫苗的方法。此外，本专利技术还涉及上述核酸构建体、重组载体或者重组宿主细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗EV71感染或者EV71感染所致疾病(例如手足口病)的药物特别是疫苗中的用途。进一步地，本专利技术还涉及一种EV71病毒样颗粒以及含有它的药物组合物例如疫苗。
技术介绍
肠道病毒(Enterovirus)又称肠病毒，是一种主要生长于肠道的RNA病毒，常见的肠病毒有柯萨奇病毒(Coxsackievirus)有A型23种与B型6种，Echovirus伊科病毒31种，和造成小儿麻痹症的Poliovirus脊髓灰质炎病毒3种，以及不分类的肠病毒68～71型，共67种。近年在亚洲和北美洲流行、可以引起手足口病的EV71就是其中的一种。2014年8月开始在美国中部10多个州区域爆发，已感染上千名儿童的EV-D68肠病毒也是其中的一种。各型之间无交叉保护反应。引起手足口病的病原体主要以肠病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型较为常见。2008年以来EV71病毒感染引起的手足口病病例越来越多。该病毒比柯萨奇病毒A16型的毒力要强得多，引起的一些重症的病例病情非常严重，并且导致了部分病例的死亡。其中EV71型C4基因亚型引起了中国1998年以来新发的手足口病疫情。引起手足口病的肠病毒EV71为单股正链小RNA病毒，其基因组含有大约7411个核苷酸。RNA中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区(UTRs)。其病毒颗粒为二十面体，为立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm。如同其他肠道病毒属成员一样，EV71型病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1，VP2，VP3和VP4，构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位组装成病毒的外壳。VP1-VP3分布在病毒外壳表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部RNA结合。抗原决定簇基本上位于VP1和VP3上。手足口病主要发生在10岁以下儿童，5岁以下儿童风险最高，年龄小的儿童比年龄大的儿童症状更严重，青少年和成人也可感染手足口病。手足口病有周期性流行的趋势。EV71感染引起的手足口病可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，会导致死亡。近年来，肠病毒71型(EV71)引起的手足口病新发疫情令人担忧。在2011年报告了160万手足口病病例，其中509例死亡。目前世界上还没有手足口病病毒(EV71)疫苗上市。在中国，手足口病灭活苗III期临床数据显示，中国研发的手足口病病毒(EV71)灭活苗有很好的保护效果，这为大规模预防和控制手足口病毒的蔓延和爆发奠定了基础。但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸等不安全因素，灭活疫苗中残存的活病毒在理论上有可能会造成手足口病的泛滥。理想的手足口病病毒(EV71)疫苗必须安全、有效、同时还应具备价廉、易于推广等优点。手足口病灭活疫苗除了存在潜在的不安全性影响其使用外，灭活疫苗的高制备成本有可能会限制该疫苗的推广。因此如何研制和生产保护性和安全性俱佳的理想的人手足口病病毒(EV71)基因工程疫苗，大幅度节约生产成本成为理想的人手足口病病毒(EV71)疫苗研发的主要方向。基因工程技术为基础的以病毒样颗粒为主的基因工程疫苗已经成功运用于现代疫苗的研发与生产。但是基因工程疫苗通常采用真核表达系统。生产成本偏高，不适合大规模推广。大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高等显著特点，因此被广泛应用生物制药行业中。糖基化修饰是真核表达系统和原核表达系统的主要区别之一，但是没有报道提到EV71病毒的衣壳蛋白，包括VP1，VP2，VP3和VP4，含有任何糖基化位点，因此用真核和原核这两种系统表达的EV71病毒的衣壳蛋白在糖基化修饰方面并没有区别。尽管如此，本专利技术人前期的研究表明，在大肠杆菌中单独或共表达装载EV71病毒外壳蛋白基因的质粒获得的外壳蛋白表达量非常低而且常常不可溶，失去了大规模商业应用的可能。综上所述，针对人手足口病病毒(EV71)引发的手足口病的防制需要，不仅迫切需要建立一种生产周期短，生产成本低，蛋白产量高的大肠杆菌来源的EV71病毒衣壳蛋白和病毒样颗粒的制备方法，更重要的是，蛋白能够正确折叠，得到需要的正确构象，组成病毒的外壳，能够在结构上高度模拟天然的EV71病毒构象。
技术实现思路
本专利技术人在前期研究中发现，如果将构成手足口病病毒EV71衣壳蛋白的4个蛋白/多肽(VP1，VP2，VP3和VP4)分别表达，存在的问题是：或者这几个蛋白不能在大肠杆菌中分别表达，或者分别表达后，处于错误折叠的状态(如后面的对比例1的实验结果所证明)。另外，如果将其中两个蛋白的基因融合后再与另外两个蛋白进行共表达，蛋白不能有效表达或者不溶，难以在结构上高度模拟天然的EV71病毒的构象(如后面的对比例2的实验结果所证明)。另一方面，本专利技术人在试图将上述4个蛋白进行串联共表达时遇到了极大的技术困难：(1)随着基因片段数目的增加，能使用的酶切位点越来越少，克隆的成功几率明显降低，到一定程度，将没有合适的酶切位点能够使用。例如，当串联表达3个基因时，用传统方法理论上要使用可能高达6个酶切位点，当串联表达4个基因时，用传统方法理论上要使用可能高达8个酶切位点，当串联表达5个基因时，用传统方法理论上要使用可能高达10个酶切位点。通常能够获得的用于蛋白表达的质粒都没有这么多可用的酶切位点。(2)当在同一个质粒中加载的基因序列(包括调控序列、连接序列等)越来越多时，质粒会变得越来越大，蛋白表达效率会越来越低，特别是那些加载在启动子和核糖体结合位点最下游基因的表达，变得极其困难。因此要保证这些串联的蛋白每一个都要能够高效表达，并且表达量能够保持在基本相同的水平，没有一个或几个蛋白的表达远远高于或低于其他蛋白的表达，并且可溶，而且能组装成病毒样颗粒，技术上有极大的难度。本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，巧妙地构建了一种核酸构建体和重组表达载体，有效、可溶地表达并纯化了人手足口病病毒(EV71)衣壳蛋白，并且其组成的EV71病毒样颗粒与天然的EV71病毒构象高度接近，具有应用于制备治疗和/或预防和/或辅助治疗EV71感染或者EV71感染所致疾病(例如手足口病)的药物(例如疫苗)的潜力。由此提供了下述专利技术：本专利技术的一个方面涉及一种核酸构建体，其包含如下的核酸分子1至4：核酸分子1：编码EV71病毒衣壳蛋白VP1，核酸分子2：编码EV71病毒衣壳蛋白VP2，核酸分子3：编码EV71病毒衣壳蛋白VP3，和核酸分子4：编码EV71病毒衣壳蛋白VP4。根本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸构建体，其包含如下的核酸分子1至4：核酸分子1：编码EV71病毒衣壳蛋白VP1，核酸分子2：编码EV71病毒衣壳蛋白VP2，核酸分子3：编码EV71病毒衣壳蛋白VP3，和核酸分子4：编码EV71病毒衣壳蛋白VP4。

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其包含如下的核酸分子1至4：核酸分子1：编码EV71病毒衣壳蛋白VP1，核酸分子2：编码EV71病毒衣壳蛋白VP2，核酸分子3：编码EV71病毒衣壳蛋白VP3，和核酸分子4：编码EV71病毒衣壳蛋白VP4。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于如下的(1)-(5)项中的任意一项或者多项：(1)所述核酸分子1至4各自独立地为单拷贝或多拷贝，例如2、3、4或5拷贝；优选地，所述核酸分子1至4均为单拷贝；(2)所述核酸构建体还包含可操作地连接的1个或多个调控序列；(3)核酸分子1与核酸分子3相邻，核酸分子2与核酸分子4相邻，例如从5’端开始，核酸分子1、2、3、4的顺序依次为1-3-2-4、1-3-4-2、3-1-2-4、3-1-4-2、2-4-1-3、2-4-3-1、4-2-1-3或者4-2-3-1；优选为3-1-2-4；(4)在核酸分子1、2、3、4各自的上游，任选地含有一个或多个RBS序列，所述RBS序列相同或不同；所述RBS序列在转录后成为mRNA上核糖体的结合位点例如SD序列；(5)在RBS序列和核酸分子1之间、在RBS序列和核酸分子2之间、在RBS序列和核酸分子3之间和/或在RBS序列和核酸分子4之间任选地含有一个或多个小分子蛋白融合标签的编码序列；所述小分子蛋白融合标签相同或不同；优选地，所述小分子蛋白融合标签为SUMO。3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中，从5’端开始，所述核酸构建体依次包含：RBS序列、SUMO编码序列、核酸分子3；RBS序列、SUMO编码序列、核酸分子1；RBS序列、SUMO编码序列、核酸分子2；以及RBS序列、SUMO编码序列、核酸分子4。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸构建体，其特征在于如下的1)-5)项中的任意一项或者多项：1)EV71病毒衣壳蛋白VP1的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，EV71病毒衣壳蛋白VP2的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，EV71病毒衣壳蛋白VP3的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，和/或EV71病毒衣壳蛋白VP4的氨基酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁于人，
申请(专利权)人：斯澳生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32