抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽天蚕素cecropin蛋白、orf‑86鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白与orf‑86鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接。该融合蛋白是抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因、orf‑86鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因与orf‑86鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白，大小约为30KD。抗菌活性研究表明产物该蛋白具有抗菌活性，构建体系解决了天然抗菌肽表达量低、对宿主伤害大、难以通过基因工程手段获得的难题，具有广泛的应用前景。

Antibacterial peptide fusion protein, preparation method and application thereof

The invention provides an antibacterial peptide fusion protein, the protein including antibacterial peptide cecropin cecropin protein, ORF 86 shahepatide protein, the antibacterial peptide cecropin cecropin protein and ORF protein between the 86 shahepatide connected through 3GSA flexible peptide fragments. The fusion protein is antibacterial peptide cecropin cecropin gene encoding protein, ORF 86 shahepatide encoding gene, and is located between the antibacterial peptide cecropin cecropin gene encoding ORF protein with 86 shahepatide gene encoding 3GSA gene encoding a flexible peptide in the level of gene fusion in prokaryotic expression of soluble recombinant protein reached the size of about 30KD. Study on the antibacterial activity of the protein indicates that the product has antibacterial activity, construct the system to solve the problem of expression quantity is low, and difficult to damage to the host by means of genetic engineering to obtain the natural antibacterial peptide, has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程、生物技术制药工程
，具体涉及一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
技术介绍
抗菌肽(Antimicrobialpeptides.AMPs)是生物体在受到病原微生物侵袭时自身诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫的主要成分,一般由20-60个氨基酸残基组成,耐高温、耐酸、水溶性好、抗菌谱广、抗菌机制特殊、杀菌快速且不产生耐药性。很多抗菌肽不仅能在较低浓度下有效抑制细菌、病毒、真菌和原虫等多种病原微生物的生长，甚至还可以杀死肿瘤细胞,而对正常的没有发生病变的真核细胞几乎没有作用。在医药行业上，抗菌肽的应用最为广泛，发展前景最好，目前科研人员在这一领域取得了丰硕的成果，如：美国马盖宁公司经过设计改造过的抗菌肽magainin对病毒和肿瘤细胞均有较好的杀伤作用；邓小娟从柞蚕中提取的抗菌肽对耐药性很强的金黄色葡萄球菌有杀菌作用。在临床应用上，抗菌肽可用于抗感染、抗病毒和抗肿瘤和提高免疫力等。已经在俄罗斯上市的抗菌肽Glutoxim可用于结核病的辅助治疗，可以提高结核双歧杆菌的清除率，缩短治疗时间，减少不良反应。已进入III期临床试验阶段的抗菌肽DiaPep277可用于糖尿病的治疗。DiaPep277通过对免疫系统进行调节，使胰岛B细胞免受自身免疫系统的破坏，从而有效控制病情。在食品工业上，抗菌肽可以作为食品保藏剂添加到食品中，减少有害防腐剂的使用。乳酸链球菌素(Nisin)是抗菌肽在食品中应用的最典型代表。抗菌肽还可以作为食品适量增效剂，如：LL-37可以作为趋化因子或细胞因子诱导剂而发挥免疫调节作用。在禽畜养殖业上，抗菌肽成为新型饲料添加剂进入人们的视野。在动物饲料中添加抗菌肽可以抑制病菌繁殖，改善动物肠道菌群结构，提高动物生产性能，如：在仔猪饲料添加抗菌肽能够增加肠道益生菌数量，控制腹泻率，提高仔猪生长性能，从而提高成活率。在水产养殖业上，水生生物抗菌肽的高效抗病毒、抗菌作用等为水产养殖的抗病害问题提供了新的解决方案。国内在水产养殖方面的研究已有很多报道，如：利用毕车酵母表达系统表达贻贝抗菌肽等。天蚕素抗菌肽(cecropins)属于阳离子抗菌肽家族中重要一族，最早于瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)蛹后发现。Boman等又进一步测定了天蚕素抗菌肽A和B的一级结构，随后天蚕素抗菌肽相继被分离、纯化，并且其氨基酸的结构特征和基因序列得到确定。到目前为止，天蚕素抗菌肽共有A、B、C、D、E5种结构，另外还发现多种类似物。天蚕素抗菌肽是世界上发现最早、研究最彻底、效果最明显的一类抗菌肽，是昆虫非特异性免疫系统的重要组成部分，一般由31～39个氨基酸组成，分子量约为3.5～4KD左右，其分子结构相对保守，主要由α螺旋构成，属于α螺旋类抗菌肽。这类抗菌肽热稳定性好、无免疫原性、抗菌能力强，能有效抑制格兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。研究发现，天蚕素抗菌肽对一些真核细胞不具毒性作用，如家蚕cecropinA和cecropinB能够抑制并杀死白色念珠菌，但对人体细胞株Jurkat没有毒性，即使在高浓度下，也不会使真核生物的红血球发生溶解破裂。除此之外，天蚕素抗菌肽具有抗病毒活性，抗寄生虫和原虫作用，抗肿瘤活性，具有免疫调节，促中性粒细胞、T细胞的化学趋势，促进伤口愈合等作用。目前，天蚕素抗菌肽已应用在动植物的生产和培育方面等，如：将天蚕素抗菌肽转入粮食作物、经济作物、果树、蔬菜等植物中，可以培育出抗病能力强的植物新品种；在动物日粮中添加天蚕素抗菌肽能够提高动物的生长性能，增强免疫力，改善动物肠道结构，促进免疫器官发育，提高免疫器官指数，提高免疫力，控制炎性反应，改善动物肠道菌群，减少应激，改善饲料转化率。但是目前抗菌肽大多都是单独存在而发挥其抗菌功能，对不同菌株的杀菌能力还是存在一定的局限性，且抗菌活性也有待提高。现代研究认为：目前最具潜力成为抗生素替代品的是抗菌肽。天蚕素是目前研究比较清楚的抗菌肽。由于人工合成抗菌肽的技术瓶颈多、工艺复杂，而且合成成本昂贵，不适宜大规模生产。单一提纯物在使用时还可能具有溶血性问题，所以现在应用在人上的天蚕素抗菌肽基本上都是通过诱导家蚕或柞蚕产生的天蚕素与这些物质的初级混合物，作为保健食品使用，其中含有的天蚕素抗菌肽是极微的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对以上现有技术，提供一种表达量高、活性强、稳定性高、对宿主毒害作用小的新型抗菌肽融合蛋白，该融合蛋白的表达体系蛋白表达量大，利于纯化复性和保持活性，且更为重要的是，该融合蛋白抗菌活性高，其本身和编码基因可应用于抗菌药物制备中，能为抗菌药物制备提供新的良好的材料来源。肝脏细胞刺激因子(HepaticStimulatorSubstance,HSS)是一类肝特异性刺激因子，最初发现于胎肝或再生肝中，它具有促进肝细胞再生，刺激肝细胞合成DNA并进行有丝分裂的功能，能启动肝细胞增殖和修复肝损伤。鲨肝活性肽APSL(鲨肝肽)是一种近似HSS活性物质，具备调节免疫、增加肝细胞增殖、修复及改善胰岛β细胞损害的功能，对肝损害及糖尿病有潜在医治作用，此外在肝损害治疗时能够调节免疫起到辅助作用。鲨鱼是丰富的海洋资源，其肝脏占自身内脏的75％，具有强烈的增强免疫的作用。我们从鲨鱼肝脏cDNA文库中筛选的长度为105bp、等电点为11的鲨肝活性肽orf-86基因具有潜在的抗菌活性(orf-86一共34个氨基酸，含有18个疏水性氨基酸和9个正电荷氨基酸，而这些正是融合蛋白抗菌的机理：通过疏水作用和正电荷的促进作用与细菌细胞膜结合，从而通过膜穿孔和非膜穿孔形式导致细菌死亡)，因此我们构建了petdute-his-sumo-APSL-cecropin重组表达载体来进行融合蛋白的表达。本专利技术所采用的技术方案为：一种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽天蚕素cecropin蛋白、orf-86鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白与orf-86鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述orf-86鲨肝肽蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQIDNO.2所示，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。即该蛋白从N端-C端依次包含了orf-86鲨肝肽蛋白、3GSA柔性肽、抗菌肽天蚕素cecropin蛋白。该蛋白是抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因、orf-86鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因与orf-86鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。所述抗菌肽融合蛋白的编码基因序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的另一目的是提供一种抗菌肽融合蛋白的制备方法，采取基因工程的方法设计融合基因表达融合蛋白，所述抗菌肽融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)采用人工合成的方法获得包含抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因序列、3GSA柔性肽编码基因序列、orf-86鲨肝肽编码基因的orf-86融合基因序列，如SEQIDNO.4所示；(2)以pET本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽融合蛋白，其特征在于：该蛋白包括抗菌肽天蚕素cecropin蛋白、orf‑86鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白与orf‑86鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述orf‑86鲨肝肽蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽融合蛋白，其特征在于：该蛋白包括抗菌肽天蚕素cecropin蛋白、orf-86鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白与orf-86鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述抗菌肽天蚕素cecropin蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述orf-86鲨肝肽蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白，其特征在于：该蛋白是抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因、orf-86鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因与orf-86鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。3.权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白的编码基因，其特征在于：其核酸序列如SEQIDNO.4所示。4.权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)采用人工合成的方法获得包含抗菌肽天蚕素cecropin蛋白编码基因序...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕正兵，李倩，林国栋，靳洋洋，陈健，舒建洪，
申请(专利权)人：浙江益肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33