磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法技术

一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，先将石榴皮粉末加入草酸铁铵水溶液中，浸泡，干燥后通入氮气，碳化，将得到的黑色固体粉碎，用蒸馏水和无水乙醇洗涤得到石榴皮磁性碳材料；取石榴皮磁性碳材料加入Tris缓冲液中，再加入模板分子菠萝蛋白酶，室温搅拌进行预聚合，然后加入功能单体多巴胺反应，磁力搅拌，将得到的聚合物离心、干燥，用洗脱剂除去模板分子菠萝蛋白酶，之后用蒸馏水洗涤至中性，干燥得到菠萝蛋白酶分子印迹聚合物，本发明专利技术制备过程简单、成本低廉，得到的印迹聚合物具有特异性强、分离效率高、可重复利用和吸附平衡时间短等特点，极大了提高了对菠萝蛋白酶的吸附容量。

Preparation method of molecular imprinting polymer of bromelain on magnetic carbon material surface

A preparation method of pineapple surface magnetic carbon materials of molecularly imprinted polymer of protease, the pomegranate peel powder into aqueous solution of ammonium ferric oxalate, soaking, drying after adding nitrogen, carbon black, will get crushed by solid, pomegranate magnetic carbon material with distilled water and ethanol washing; from pomegranate peel magnetic carbon materials added Tris buffer, adding template bromelain, stirring at room temperature, pre polymerization, and then adding functional monomer dopamine reaction, magnetic stirring, centrifugation and drying the polymer obtained by eluent, removing the template molecule bromelain, after washing with distilled water to neutral, drying to obtain the bromelain molecular imprinting polymer, the invention has the advantages of simple preparation process, low cost, imprinted polymer obtained has strong specificity, high separation efficiency, repeat The adsorption capacity of bromelain was greatly improved by the short time of using and adsorption.

【技术实现步骤摘要】
磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法
本专利技术属于表面分子印迹聚合物
，具体涉及一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法。
技术介绍
菠萝蛋白酶(bromelain,BR)是从凤梨属植物菠萝中提取的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，也称凤梨酶或凤梨酵素。因其可以将蛋白质、酰胺、肽和脂等分解成小分子结构的物质，常常被当做食品的添加剂，广泛的应用于肉质的嫩化、啤酒和白酒的澄清、干酪生产和水解蛋白等方面。此外，菠萝蛋白酶在医药方面具有极高的药物价值和治疗价值。研究表明菠萝蛋白酶具有消炎、抗肿瘤、抑制血小板聚集、溶解纤维蛋白、调节细胞因子和免疫、及皮肤清创的特性，也具有促进药物的吸收、促进伤口愈合和改善心血管循环系统的作用。目前，商业化分离纯化菠萝蛋白酶的方法主要有：高岭土吸附法、沉淀法、膜分离法以及单宁沉淀法和超滤浓缩法等。但这些分离方法普遍存在生产工艺繁杂，提取效率低，选择性差，对环境有污染等问题。因此，需要一种特异性强、分离效率高、稳定性好的从复杂基质中提取菠萝蛋白酶的分离分析方法。分子印迹技术(molecularlyimprintingtechnique,MIT)是一种合成对特定模板分子具有专一识别能力的分子印迹聚合物的新型技术。由于其具有结构预定性、识别特异性、性质稳定性和广泛适用性的特点，已成功的应用于分离分析、仿生催化、药物释放、生物传感器等领域。目前，小分子的印迹聚合物技术已趋于成熟，但对于水溶性蛋白质的分子印迹聚合物的制备，由于蛋白质存在体积庞大、结构复杂、可结合位点多、容易变性失活等特点，常规的合成印迹聚合物的方法对其印迹比较困难，适用性较差。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，具有简单方便、分离效率高、特异性强和可重复利用的优点。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)将石榴皮粉末加入草酸铁铵水溶液中得到质量浓度为350.0mg/mL混合液，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮气，650℃碳化3h，将得到的黑色固体粉碎，用蒸馏水和无水乙醇洗涤得到石榴皮磁性碳材料；2)取石榴皮磁性碳材料加入Tris缓冲液中得到其质量浓度为2.0～8.0mg/mL的混合液，再加入模板分子菠萝蛋白酶使其质量浓度在1.0～2.0mg/mL之间，室温搅拌2h进行预聚合，然后加入功能单体多巴胺使其质量浓度在2.0～10.0g/L之间，反应温度为25～40℃，磁力搅拌6～24h，将得到的聚合物离心、干燥，用洗脱剂除去模板分子菠萝蛋白酶，之后用蒸馏水洗涤至中性，60℃干燥得到菠萝蛋白酶分子印迹聚合物。所述的步骤1)中草酸铁铵水溶液浓度为0.8M。所述的步骤2)中Tris缓冲液pH值为8.0～8.6。所述的步骤2)中洗脱剂为2％十二烷基磺酸钠-2％冰醋酸混合溶液或2％氯化钠-2％冰醋酸混合溶液。本专利技术的优点在于：以石榴皮碳化得到的磁性多孔碳材料为载体，结合多巴胺自聚合技术，通过表面印迹法温和的制备了菠萝蛋白酶分子印迹聚合物。制备过程简单、成本低廉，得到的印迹聚合物具有特异性强、分离效率高、可重复利用和吸附平衡时间短等特点，极大了提高了对菠萝蛋白酶的吸附容量。并且，由于其具有磁响应性，在外加磁场的条件下可实现对聚合物的快速分离，为蛋白质的分离和纯化提供了一种新方法。附图说明图1为实施例1石榴皮磁性碳材料和菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的扫描电镜图，其中图1a为石榴皮磁性碳材料；图1b为菠萝蛋白酶印迹聚合物(MIP)；图c为空白分子印迹聚合物(NIP)。图2为实施例1菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的吸附动力学曲线图。图3为实施例1菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的静态吸附曲线图。图4为实施例1菠萝蛋白酶分子印迹聚合物和空白的分子印迹聚合物对溶菌酶(Lyz)、菠萝蛋白酶(BR)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和胃蛋白酶(pepsin)的吸附量柱状图。图5为实施例1～4合成过程中石榴皮磁性碳材料含量对菠萝蛋白酶分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物吸附效果的影响柱状图。图6为实施例5～8合成过程中功能单体多巴胺含量对菠萝蛋白酶分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物吸附效果的影响柱状图。图7为实施例9～11合成过程中合成时间对菠萝蛋白酶分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物吸附效果的影响柱状图。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1，一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL0.8M草酸铁铵水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮气，650℃碳化3h，将得到的黑色固体粉碎，用蒸馏水和无水乙醇洗涤得到石榴皮磁性碳材料；2)称取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mLpH8.5的Tris缓冲液中，再加入0.02g模板分子菠萝蛋白酶，室温搅拌2h进行预聚合，然后加入0.12g功能单体多巴胺，35℃磁力搅拌12h，将得到的聚合物离心、干燥，用2％十二烷基磺酸钠-2％冰醋酸混合溶液作为洗脱剂除去模板分子菠萝蛋白酶，之后用蒸馏水洗涤至中性，60℃干燥得到菠萝蛋白酶分子印迹聚合物(MIP)。空白分子印迹聚合物(NIP)的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子菠萝蛋白酶。本实施例的有益效果为：用实施例1制备得到的菠萝蛋白酶分子印迹聚合物进行摇床吸附实验，吸附后的上清液用荧光分光光度仪于280nm激发波长下进行检测，通过荧光光谱图计算得到其对菠萝蛋白酶的吸附量为135mg/g、印迹因子2.25。参照图1，从图1可以看出，与图a石榴皮磁性碳材料的扫描电镜图相比，合成的菠萝蛋白酶印迹聚合物(MIP)和空白分子印迹聚合物(NIP)的表面明显有粗糙颗粒附着，证明了分子印迹聚合物涂层的沉积。参照图2，从图2可以看出，随着吸附时间的增加，印迹材料对菠萝蛋白酶的吸附量不断上升，40min时基本达到吸附平衡，饱和吸附量为135mg/g。实验表明，印迹材料具有较快的吸附速率，平衡时间较短。原因在于一方面实验采用具有较大比表面积的磁性多孔碳材料，导致吸附速度加快；另一方面表面印迹法形成的聚多巴胺层中的印迹孔穴及孔道较浅，菠萝蛋白酶分子扩散阻力小，很容易进入印迹孔穴与结合位点接触。参照图3，从图3可以看出，MIPs对菠萝蛋白酶的吸附容量远远大于NIPs对菠萝蛋白酶的吸附容量。当菠萝蛋白酶的初始浓度大于180ug/mL时，MIPs对菠萝蛋白酶的吸附量无明显变化达到吸附平衡，饱和吸附量为134mg/g、印迹因子为2.21，证明了合成的印迹聚合物存在特异性吸附孔穴。参照图4，从图4可以看出，印迹聚合物对菠萝蛋白酶的吸附能力明显强于其他蛋白质。印迹聚合物表面的聚合物薄层内分布有大量菠萝蛋白酶的印迹孔穴，这些孔穴在尺寸大小、空间结构和作用位点等方面与菠萝蛋白酶高度匹配，与溶菌酶(Lyz)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和胃蛋白酶(pepsin)的匹配度低，导致四者被吸附能力明显弱于菠萝蛋白酶。上述实验结果表明了印迹材料对菠萝蛋白酶具有特异的识别选择性和高度的结合亲和性。实施例2，一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将石榴皮粉末加入草酸铁铵水溶液中得到质量浓度为350.0mg/mL混合液，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮气，650℃碳化3h，将得到的黑色固体粉碎，用蒸馏水和无水乙醇洗涤得到石榴皮磁性碳材料；2)取石榴皮磁性碳材料加入Tris缓冲液中得到其质量浓度为2.0～8.0mg/mL的混合液，再加入模板分子菠萝蛋白酶使其质量浓度在1.0～2.0mg/mL之间，室温搅拌2h进行预聚合，然后加入功能单体多巴胺使其质量浓度在2.0～10.0g/L之间，反应温度为25～40℃，磁力搅拌6～24h，将得到的聚合物离心、干燥，用洗脱剂除去模板分子菠萝蛋白酶，之后用蒸馏水洗涤至中性，60℃干燥得到菠萝蛋白酶分子印迹聚合物。

【技术特征摘要】
1.一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将石榴皮粉末加入草酸铁铵水溶液中得到质量浓度为350.0mg/mL混合液，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮气，650℃碳化3h，将得到的黑色固体粉碎，用蒸馏水和无水乙醇洗涤得到石榴皮磁性碳材料；2)取石榴皮磁性碳材料加入Tris缓冲液中得到其质量浓度为2.0～8.0mg/mL的混合液，再加入模板分子菠萝蛋白酶使其质量浓度在1.0～2.0mg/mL之间，室温搅拌2h进行预聚合，然后加入功能单体多巴胺使其质量浓度在2.0～10.0g/L之间，反应温度为25～40℃，磁力搅拌6～24h，将得到的聚合物离心、干燥，用洗脱剂除去模板分子菠萝蛋白酶，之后用蒸馏水洗涤至中性，60℃干燥得到菠萝蛋白酶分子印迹聚合物。2.根据权利要求1所述的一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中草酸铁铵水溶液浓度为0.8M。3.根据权利要求1所述的一种磁性碳材料表面菠萝蛋白酶分子印迹聚合物的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅强，徐欣雅，刘瑞林，郭鹏琦，周玉兰，曾爱国，常春，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61