本发明专利技术涉及一种云南臭蛙降血糖肽及制备方法及其在促进胰岛β细胞增殖药物和糖尿病治疗中的应用。云南臭蛙降血糖肽具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，可从云南臭蛙皮肤分泌液中分离得到。云南臭蛙降血糖肽具有促进胰岛β细胞增殖及胰岛素释放的显著特点，可明显降低2型糖尿病模型动物的血糖，具有结构简单、人工合成方便的有益特点。可应用于促进胰岛β细胞增殖药物和糖尿病治疗药物的制备。
Hypoglycemic peptide of Yunnan frog and preparation method and application thereof
The invention relates to a hypoglycemic peptide of Yunnan frog and a preparation method thereof, and the application of the hypoglycemic peptide in promoting the proliferation of pancreatic beta cell and the treatment of diabetes. Yunnan frog hypoglycemic peptides with the amino acid sequence of SEQ ID sequence table NO:1 shows, from the Yunnan frog skin secretion of isolated liquid. Yunnan frog hypoglycemic peptide can promote the proliferation and characteristics of islet beta cell insulin release, can significantly reduce the blood glucose of type 2 diabetic animal model, has the advantages of simple structure, convenient synthetic advantages. The invention can be used for the preparation of beta cell proliferation drugs and the treatment of diabetes mellitus.
【技术实现步骤摘要】
云南臭蛙降血糖肽及制备方法及其应用
本专利技术提供了一种来源于两栖动物云南臭蛙降血糖肽及制备方法及其应用，属生物医学领域。
技术介绍
在自然界漫长的进化过程中，很多动物都产生了具有特定生物学活性的肽类分子，作为高效能的防御和捕食的分子武器，如蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒素、蛙皮毒素等。自然界亿万年的“加速进化选择”赋予动物多肽类活性分子具有高活力(较其它类型化合物活性高103-106倍)和高选择性的特征(可有效区分膜离子通道亚型)；另一方面，在协同进化驱使下，动物多肽类活性分子广泛存在多拷贝基因家族和高进化速率，从而呈现惊人的分子水平生物多样性，如每种蜘蛛毒素至少有300种活性多肽、每种蝎子至少有100种以上的活性多肽，估计自然界中的有毒动物含有3000万种以上的活性多肽。天然活性多肽已成为新药作用靶点发现与确认的有力工具以及新药创制先导化合物的重要来源,在基础科学研究、新兴生物产业、创新药物研发中具有独特和不可替代的作用。艾塞那肽Exenatide(商品名Byetta)是由AmylinPharmaceuticals与礼来(EliLilly)公司共同开发的新型2型糖尿病治疗药物。Exendin-4最初是由被称为“希拉巨蜥”的美国大毒蜥(Helodermasuspectum)分离纯化得到的，是一种含有39个氨基酸的GLP-1(胰高血糖素样肽-1)类似物，其一级结构与人GLP-1有53％的同源性，但显示出更强的稳定性和更长效的作用。艾塞那肽最终被礼来公司开发成化学合成药物，其氨基酸序列与天然纯化的Exendin-4完全相同，化学合成的Exendin-4被称为Exenatide。2009年8月艾塞那肽在我国上市，国内商品名为“百泌达”。百泌达具有全新的降糖机制，用于二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍与磺酰脲类联合应用不能充分控制血糖的2型糖尿病患者，已成为生物医药中连续多年销售额超过十亿美元的“重磅炸弹”。艾塞那肽的成功表明了从天然动物肽类活性分子发掘新型2型糖尿病治疗药物的现实可行性。两栖类动物皮肤分泌物中含有大量未知功能的活性多肽。蛙科臭蛙属在整个两栖类动物的进化中占有重要位置，是蛙科动物从真蛙类向水蛙类进化的重要过渡类群。我们从云南、贵州、四川等地采集到了中国特有的9种臭蛙，通过蛋白质组学和基因组学手段，从这9种臭蛙皮肤里面识别了728条不同的成熟活性肽分子，其中662条为首次报道。这些活性肽被分为97个家族，其中71个家族为首次命名。臭蛙活性肽具有抗菌、抗氧化、免疫调节和促进胰岛素释放等多种生物学活性(YangX,LeeWH,ZhangY.ExtremelyabundantantimicrobialpeptidesexistedintheskinsofninekindsofChineseodorousfrogs.JProteomeRes.2012，11:306-319.)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种云南臭蛙(Odorranaandersonii)降血糖肽及其制备方法，本专利技术还提供云南臭蛙降血糖肽在促进胰岛β细胞增殖药物和糖尿病治疗中的应用。云南臭蛙降血糖肽具有促进胰岛β细胞增殖及胰岛素释放的显著特点，可明显降低2型糖尿病模型动物的血糖。云南臭蛙降血糖肽具有结构简单、人工合成方便的有益特点。可应用于促进胰岛β细胞增殖药物和糖尿病治疗药物的制备。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：云南臭蛙Odorranaandersonii降血糖肽OA-A1，所述降血糖肽具有下述序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：LeuValGlyLysLeuLeuLysGlyAlaValGlyAspValCysGlyLeuLeuProIleCys。本专利技术同时提供了云南臭蛙降血糖肽前体及成熟肽的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列编码本专利技术的云南臭蛙降血糖肽前体及成熟肽。本专利技术的云南臭蛙降血糖肽的制备方法，从云南臭蛙皮肤分泌液中分离得到，纯化的云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，即从云南臭蛙皮肤分泌物通过生物化学分离手段，通过分子筛、高压液相反相C18柱分离纯化得到。本专利技术的云南臭蛙降血糖肽的制备方法，采用固相化学法合成，合成的云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。所述的固相化学法合成即根据分离纯化、活性测定、质谱分子量测定、蛋白质序列测定结合编码云南臭蛙降血糖肽OA-A1前体蛋白的完整开放阅读框(ORF)得到天然云南臭蛙降血糖肽的氨基酸序列，用全自动多肽合成仪合成其全序列；通过高压液相HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化；然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fastatombombardmentmassspectrometry,FAB-MS)，用全自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。本专利技术云南臭蛙降血糖肽也可以使用本领域技术人员熟知的方法，还可以通过遗传工程的方法制备。云南臭蛙降血糖肽作为制备促进胰岛β细胞增殖及降血糖药物的应用。将本专利技术的云南臭蛙降血糖肽氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同的降血糖肽前体及成熟肽序列。因此，云南臭蛙降血糖肽具有显著的促进胰岛β细胞增殖和胰岛素释放的作用，在2型糖尿病动物模型上能显著降低模型动物的血糖。与其它来源降血糖肽相比，该降血糖肽具有结构简单、人工合成方便、降血糖作用明确的有益特点。附图说明图1为本专利技术的云南臭蛙降血糖肽开放阅读框核酸序列及其编码的蛋白质序列，其中斜体加框序列为本发云南臭蛙降血糖肽的成熟序列。图2为本专利技术的云南臭蛙降血糖肽分子筛层析图谱，图中横线部分为具有促进胰岛素分泌的活性成分。图3为本专利技术的云南臭蛙降血糖肽的HPLC层析图谱，图中箭头标示部分为最终分离纯化得到的云南臭蛙降血糖肽。图4为纯化得到的云南臭蛙降血糖肽质谱分子量测定图谱。图5为云南臭蛙降血糖肽对小鼠胰岛β细胞增殖和胰岛素释放的影响。A)对小鼠胰岛β细胞增殖的作用；B)对小鼠胰岛β细胞分泌胰岛素的作用。图6为云南臭蛙降血糖肽对2型糖尿病小鼠血糖及葡萄糖耐受能力(OGTT)的影响。A)对2型糖尿病小鼠血糖的影响；B)对2型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力(OGTT)的影响。图7为云南臭蛙降血糖肽对小鼠胰岛细胞的影响。A)正常小鼠对照；B)糖尿病小鼠生理盐水对照；C)糖尿病小鼠云南臭蛙降血糖肽1nmol/kg；D)糖尿病小鼠云南臭蛙降血糖肽10nmol/kg。I代表胰岛细胞。具体实施方式实施例1云南臭蛙降血糖肽的分离纯化、活性测定及质谱和蛋白质序列测定。1)云南臭蛙皮肤分泌物的制备：用电理疗仪刺激蛙皮肤，蛙产生大量皮肤分泌物，然后用0.1MpH7.4PBS缓冲液(称取13.97gK2HPO4和2.69gKH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml)冲洗皮肤，并收集冲洗液，合并冲洗液经Christ冻干机(型号Alpha1-4)冰冻干燥得到云南臭蛙皮肤分泌物。2)云南臭蛙降血糖肽的分离纯化：2.1分子筛柱层析：将冻干的皮肤分泌物1g用2ml蒸馏水溶解，然后将溶解的分泌物12000转/分离心10分钟，去除沉淀后上清液通过Sephedex-G75分子筛柱(2.6×100cm)进行分离。缓冲液为：25mMTris-HCl，本文档来自技高网...
【技术保护点】
云南臭蛙降血糖肽，其特征在于：所述降血糖肽具有下述序列表中的氨基酸序列SEQ ID NO:1：
【技术特征摘要】
1.云南臭蛙降血糖肽，其特征在于：所述降血糖肽具有下述序列表中的氨基酸序列SEQIDNO:1：2.权利要求1所述云南臭蛙降血糖肽的制备方法，其特征在于：从云南臭蛙皮肤分泌液中分离得到，纯化的云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文辉，张云，杨新旺，商伟杰，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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