RBBP4靶向多肽和抗肿瘤多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种RBBP4靶向多肽和一种抗肿瘤多肽及其应用。所述RBBP4靶向多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述抗肿瘤多肽包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域，所述RBBP4靶向结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接RBBP4靶向结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
RBBP4靶向多肽和抗肿瘤多肽及其应用
本专利技术涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种RBBP4靶向多肽和一种抗肿瘤多肽及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤严重威胁人类健康，是世界范围内一个主要的致死因素。常规的肿瘤治疗手段包括化疗、放疗、手术切除等。但这些方法通常会对机体的正常组织带来损伤，造成很大的毒副作用，给肿瘤患者带来极大的痛苦。因此，特异性高、疗效显著的肿瘤靶向治疗方法引起了人们的极大兴趣。肿瘤靶向疗法指通过干扰参与肿瘤细胞发生、发展和扩散相关的特殊分子，进而抑制肿瘤进展的治疗方法。肿瘤靶向疗法区别于传统化疗，有其特定的靶标分子，人们也正在努力开发各种肿瘤靶向疗法。目前认为，靶向性多肽是比较理想的肿瘤靶向治疗手段，具有以下优势：1)血浆清除速度快，亲和力高，特异性强；2)良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；3)易于化学合成，且免疫原性低，可避免单克隆抗体治疗的不足。因此，近年来许多学者应用肽库技术寻找可能与肿瘤细胞特异结合的短肽，以达到靶向治疗肿瘤的目的。多梳抑制复合物2(PRC2)是一类重要的表观遗传抑制复合物，能通过调控组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27)，抑制基因的转录。PRC2在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。相对于正常细胞，肿瘤细胞中PRC2复合物对抑癌基因的抑制活性显著增强。PRC2在肿瘤中的关键作用使得它成为肿瘤表观遗传疗法的重要靶标。PRC2与多种肿瘤，如结肠癌、乳腺癌、白血病、肝癌、口腔癌的相关性已引起人们日益增多的关注。人类PRC2复合物由四个核心组分组成，即，胚胎外胚层发育蛋白(EED)、果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)、Zeste人12同源物1抑制因子2(SUZ12)和RBBP4。其中，EZH2是核心催化亚基，RBBP4与SUZ12负责结合核小体，EED能增强EZH2的催化作用。已有多项研究针对EZH2设计多肽及药物，抑制其功能，达到治疗肿瘤的作用，然而尚缺乏针对RBBP4蛋白设计的多肽或药物研究。RBBP4蛋白是WD40家族中的一员，定位于细胞核内，能直接结合组蛋白H3-H4复合物，也参与多种组蛋白结合复合物的形成；除PRC2复合物以外，RBBP4参与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)复合物、核小体重塑脱乙酰基酶(NuRD)复合物的形成，调节染色质结构及功能。对RBBP4进行靶向结合，能削弱PRC2复合物的形成，并抑制其催化活性，从而达到治疗肿瘤的效果。细胞穿膜肽(CPP)是一类具有很强穿透细胞膜能力的短肽，具有正电荷，既可以从生物体内提取，也可以通过人工合成。该多肽可以直接穿透细胞膜，进入细胞浆和细胞核，有利于进一步作为载体携带药物进行抗肿瘤治疗。同时，对正常组织毒副作用小，从根本上改善基因治疗的安全与伦理问题。对进一步研制高效、安全的靶向治疗药物具有重要意义，可望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。
技术实现思路
为解决以上问题，专利技术人制备了一种靶向RBBP4的多肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。基于该研究，本专利技术提供了一种RBBP4靶向多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了上述RBBP4靶向多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域，所述RBBP4靶向结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述RBBP4靶向结构域位于所述抗肿瘤多肽的C端，并且所述穿膜结构域位于N端。本专利技术还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的优点在于，本专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接RBBP4靶向结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。附图说明图1为用RBP-25和对照多肽孵育肿瘤细胞后的荧光显微镜照片；图2为不同浓度的RBP-25对SW480增殖活性影响的统计图；图3为不同浓度的RBP-25对SK-N-SH增殖活性影响的统计图；图4为RBP-25处理不同时间对SW480增殖活性影响的统计图；图5为RBP-25处理不同时间对SK-N-SH增殖活性影响的统计图；图6为Transwell实验的结晶紫染色照片；图7为根据图6计数得到的IMR32细胞的Transwell实验的细胞计数图；图8为根据图6计数得到的SK-N-SH细胞的Transwell实验的细胞计数图；图9为倒置显微镜下动态观察HUVEC小管形成的照片；图10为RBBP4抗体免疫沉淀EZH2/SUZ12的westernblot检测照片；图11为RBP-25处理后SK-N-SH细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的westernblot检测照片；图12为RBP-25处理后MCF-7细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的westernblot检测照片；图13为RBP-25处理后SK-N-SH细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相对转录水平；图14为RBP-25处理后MCF-7细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相对转录水平。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.RBBP4靶向多肽的鉴定以及抗肿瘤多肽的合成通过生物信息学和蛋白定点突变技术，获取针对RBBP4的多肽氨基酸序列SEQIDNO:2。通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域(SEQIDNO:1)，为了研究方便，我们还在RBBP4靶向结构域的C端标记的异硫氰酸荧光素标记，氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-MEILQSDYILAQVK-FITC(命名为RBP-25)，由武汉百意欣生物技术有限公司合成。合成步骤如下：1)称取n当量树脂放入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的二异丙基乙胺(DIEA)，适量的二甲基甲酰胺(DMF)、DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)、DIEA、DMF、DCM，氮气鼓泡反应60分钟。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净。2)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐(HBTU和DIEA，氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，洗净，茚三酮检测。3)依步骤2)的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰。4)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％三氟乙酸、2％乙二硫醇、2％三异丙基硅烷、1％水)，震荡，滤掉树脂。5)得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RBBP4靶向多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种RBBP4靶向多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的RBBP4靶向多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域，所述RBBP4靶向结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：童强松，郑丽端，李聃，宋华杰，叶霖，方二虎，杨枫，王晓静，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42