一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法，包括步骤：A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点中并制成病毒颗粒；B、利用磁珠特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染，得永生化免疫细胞；C、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，然后转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；D、利用DNA重组技术将单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点中并制成病毒颗粒，再转染条件自杀性免疫细胞，得条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。解决了现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法
本专利技术涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法。
技术介绍
免疫细胞对肿瘤细胞具有免疫监视和杀伤作用，尤其是携带有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体（ScFV）的免疫细胞能高效特异性的识别、结合以及杀死相关的肿瘤细胞。比如，携带有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体T淋巴细胞技术（CAR-T）在治疗急性淋巴细胞白血病以及淋巴瘤中，肿瘤患者的缓解率高达80%以上。然而，传统的CAR-T细胞技术具有潜在的细胞因子风暴等副作用，该副作用若不能有效控制，造成肿瘤患者死亡的概率在5-10%；另一方面，常规的CAR-T细胞技术需个性化制备每个患者的CAR-T细胞，更是限制了CAR-T技术不能真正广泛临床应用。而最近兴起的带有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体NK细胞技术（CAR-NK），虽然细胞因子风暴的概率大大降低，但其在体内存活时间短，需要多次注射，这样不仅大大提高治疗成本，可控性也较差。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法，旨在解决现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。本专利技术的技术方案如下：一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，包括步骤：A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；B、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；C、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因的克隆载体，然后将所述自杀基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；D、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述细胞永生化基因为SV40大T抗原永生化基因、端粒逆转录酶基因中的一种或多种。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述自杀基因为单纯孢疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因、人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶基因中的一种或多种。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述单链抗体基因为CD19单链抗体基因、CD20单链抗体基因、CD30单链抗体基因、CD33单链抗体基因、CD38单链抗体基因、EGFRvIII单链抗体基因、ERBB单链抗体基因、FAP单链抗体基因、GD-2单链抗体基因、HER2单链抗体基因、MESOTHELIN单链抗体基因、PSMA单链抗体基因、WT1单链抗体基因、NY-ESO-1单链抗体基因、MART-1单链抗体基因、PD1单链抗体基因中的一种或多种。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述第一克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第二克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第三克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第一克隆载体和第三克隆载体带有不同的荧光标记基因。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述第一克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，所述第二克隆载体为附加体载体pCEP4，所述第三克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述一种免疫细胞为T细胞或NK细胞；当从人外周血中选择T细胞时，所述步骤B具体为：采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理，取磁珠吸附的细胞即为富集后的T细胞，富集后的T细胞用添加有15~25U/mL白介素2、50-100U/mL抗CD3抗体、50-100U/mL抗CD28抗体、5%~15%胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化T细胞；当从人外周血中选择NK细胞时，所述步骤B具体为：采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行磁珠负选处理，得CD3-细胞，再通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞，获得的CD56+CD3-细胞即为NK细胞，富集后的NK细胞用添加有15~25U/mL白介素2、5%~15%胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化NK细胞。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述步骤C具体为：选择附加体载体pCEP4，采用DNA重组技术将TK基因插入到pCEP4多克隆位点之间，构建TK的附加体表达载体pCEP4-TK，以电穿孔的方式将pCEP4-TK转入步骤B中所制备的永生化免疫细胞，得到携带有附加体pCEP4-TK的永生化免疫细胞，然后利用添加有潮霉素的培养基选择潮霉素抗性的细胞，即为条件自杀性免疫细胞。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45~55nm的磁珠，在磁珠与单核细胞的比例为12:1~20:1、温度3~5℃下处理所述单核细胞3~5h，然后以900~1100RPM离心4~6mins，取沉淀；所述用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45~55nm的磁珠，在磁珠与人外周血中细胞的比例为12:1~20:1、温度3~5℃下处理1.5~2.5h，然后以900~1100RPM离心4~6mins，取离心液；通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞的具体过程为：利用带有抗CD56抗体且直径为45~55nm的磁珠，在磁珠与CD3-细胞的比例为12:1~20:1、温度4℃下处理3~5h，然后900~1100RPM离心4~6mins，取沉淀。一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞，其中，采用上述任一方法制备而成。有益效果：本专利技术通过病毒载体将携带有SV40大T抗原永生化基因或端粒逆转录酶基因，将T细胞或NK细胞做成可以永久传代的永生化免疫细胞，然后利用克隆载体的方法将携带有药物诱导性自杀基因、以及有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体同时整合到以上制备的永生化免疫细胞上，如此制备的免疫细胞在体内的存活时间可以通过药物严格控制及清除，避免了导入的用于治疗的外源性免疫细胞长期存在所带来的潜在副作用，解决了现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。附图说明图1为本专利技术条件自杀性免疫细胞制备方法较佳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；B、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；C、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因的克隆载体，然后将所述自杀基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；D、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。

【技术特征摘要】
1.一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；B、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；C、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因的克隆载体，然后将所述自杀基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；D、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。2.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞永生化基因为SV40大T抗原永生化基因、端粒逆转录酶基因中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述自杀基因为单纯孢疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因、人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶基因中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述单链抗体基因为CD19单链抗体基因、CD20单链抗体基因、CD30单链抗体基因、CD33单链抗体基因、CD38单链抗体基因、EGFRvIII单链抗体基因、ERBB单链抗体基因、FAP单链抗体基因、GD-2单链抗体基因、HER2单链抗体基因、MESOTHELIN单链抗体基因、PSMA单链抗体基因、WT1单链抗体基因、NY-ESO-1单链抗体基因、MART-1单链抗体基因、PD1单链抗体基因中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第二克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第三克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第一克隆载体和第三克隆载体带有不同的荧光标记基因。6.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，所述第二克隆载体为附加体载体pCEP4，所述第三克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato。7.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述一种免疫细胞为T细胞或NK细胞；当从人外周血中选择T细胞时，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小青，陈光风，史秀娟，朱良，
申请(专利权)人：佰通生物技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32