一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法。采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，并进而制得含有TUBB3‑2A‑mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs‑TUBB3‑mRFP；最终制得的hiPSCs‑TUBB3‑mRFP高效分化为神经元。本发明专利技术所述方法，通过定向诱导分化程序，把hiPSCs‑TUBB3‑mRFP高效分化为神经元，从而为流式细胞仪高通量、特异性分选神经元提供了实验基础，并进一步为筛选神经系统药物、检测化合物/环境毒素的神经遗传毒性提供技术平台。

【技术实现步骤摘要】
一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法。
技术介绍
胚胎干细胞（embryonicstemcells，EScells）是来源于哺乳动物囊胚内细胞团（innercellmass，ICM）的多潜能干细胞，具有无限自我更新和多向分化能力。ES细胞在疾病模型建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价等方面极具应用价值。然而，使用人类胚胎涉及伦理和免疫排斥问题，科学家们曾尝试通过不同途径实现体细胞重编程以获取ES细胞样多潜能干细胞，早期途径主要有体细胞核移植、细胞融合和细胞提取物诱导，但亦因面临伦理、免疫排斥、技术、宗教和法律等问题限制了多潜能干细胞的研究与应用。而经特定转录因子诱导的体细胞重编程克服了上述障碍，无疑是获取多潜能干细胞的理想途径之一。2006年，日本Yamanaka研究小组将逆转录病毒介导的Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc4个基因转入小鼠成纤维细胞，首次将体细胞直接重编程为ES细胞样的多潜能干细胞，并命名为诱导多潜能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs），标志着体细胞重编程为iPS细胞技术诞生。iPSCs是一种具有自我复制能力、且在一定条件下可以分化成多种靶向功能细胞的干细胞，由于iPSCs具备分化为人体内所有组织细胞的潜能，因此，多潜能干细胞的使用，已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。迄今为止，大鼠、人、猪、猴和兔的iPS细胞系皆已建立，并证实小鼠iPS细胞具有ES细胞的发育全能性。iPS细胞在疾病模型建立与机理研究、药物的发现与评价方面已取得重大成果，并有望用于细胞治疗。鉴于人iPSCs（hiPSCs）在疾病机理探索和再生医学等方面的巨大应用前景，iPSCs专利技术者荣获2012年度生理学或医学诺贝尔奖。而诱导hiPSCs定向分化为神经元是研究神经元发育、神经系统疾病机制、筛选神经系统药物、检测化合物/环境毒素的神经遗传毒性、治疗神经系统疾病的不可或缺的技术平台。携带有报告基因的hiPSCs源性神经元是实现上述研究目的之有力武器。然而如何稳定获得这种hiPSCs源性神经元依然是目前亟待解决的难题。目前，制备携带报告基因hiPSCs源性神经元的策略主要包括：（1）外源性神经元启动子控制报告基因表达，通过逆转录病毒/慢病毒载体随机整合在hiPSCs基因组中，其缺点是由于整合位点的随机性，使得外源性报告基因有可能影响整合位点附近功能基因的表达，也导致实验的可重复性受到一些限制；（2）通过同源重组的方式以内源性神经元启动子控制报告基因表达，但是导致同源重组的效率非常低下。现有技术中制备源性神经元通常采用有两种方式：（A）报告基因被敲入、替换神经元标识蛋白的一条等位基因，这种方式的缺点是导致神经元标识蛋白表达量降低从而影响其正常生理功能；（B）神经元标识蛋白与报告基因形成融合蛋白，这种方式的缺点是可能会影响神经元标识蛋白的某些功能，也有可能导致报告基因的失活。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，获得TUBB3-2A-mRFP序列，并进而制得含有TUBB3-2A-mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；并通过定向诱导分化程序，将制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化为神经元，即得。具体的，所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，包括如下步骤：（1）构建靶向载体pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计PrimerTUBB3-1-short和PrimerTUBB3-2为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-5HA；PrimerTUBB3-1-short：ggatgtggtgcggaaggagtg；PrimerTUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；以TUBB3-5HA为模板，设计PrimerTUBB3-1-longnew和PrimerTUBB3-2为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段的TUBB3-5HA-long；PrimerTUBB3-1-longnew：cgggctgcagcgaccaatgtggggatgtggtgcggaaggagtg；PrimerTUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计PrimerTUBB3-5和PrimerTUBB3-6-short为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-3HA；PrimerTUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；PrimerTUBB3-6-short：actgtggagggctgggcagtc；以得到的TUBB3-3HA为模板，设计PrimerTUBB3-6-longnew和PrimerTUBB3-5为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段TUBB3-3HA-long；PrimerTUBB3-6-longnew：gataagcttgatatccactgtggactgtggagggctgggcagtc；PrimerTUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；以mRFP序列为模板，设计PrimerTUBB3-3和PrimerTUBB3-4为引物，通过PCR反应得到与TUBB3-5HA-long有重叠的DNA片段TagRFP；PrimerTUBB3-3：cggaggcccagggccccaagagggcaaagagggccacgaacttctctctgttaaagc；PrimerTUBB3-4：cactccagctgcgagcagctctatcaattaagtttgtgccccag；取纯化的pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long片段混匀，通过Gibson克隆试剂盒制备得到pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA靶向载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；（2）构建sgRNA导向载体设计如下结构的序列1和序列2混匀，高温加热，退火后与pBS-U6-sgRNA载体连接，制备得到pBS-U6-TUBB3-sgRNA导向载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；序列1：CACCGGTACATCTCGCCCTCTTCCT；序列2：AAACAGGAAGAGGGCGAGATGTACC；（3）构建携带EGFP报告基因的Cas9表达载体取如SEQIDNo.6所示核苷酸序列结构的IRES-EGFP序列亚克隆到pCAG-Cas9-bpA载体中的Cas9片段的下游，构建得到pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表达载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；（4）制备hiPSCs单细胞悬液取Targetvector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，获得TUBB3‑2A‑mRFP序列，并进而制得含有TUBB3‑2A‑mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs‑TUBB3‑mRFP；并通过定向诱导分化程序，将制得的hiPSCs‑TUBB3‑mRFP高效分化为神经元，即得。

【技术特征摘要】
1.一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，获得TUBB3-2A-mRFP序列，并进而制得含有TUBB3-2A-mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；并通过定向诱导分化程序，将制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化为神经元，即得。2.根据权利要求1所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建靶向载体pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计PrimerTUBB3-1-short和PrimerTUBB3-2为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-5HA；PrimerTUBB3-1-short：ggatgtggtgcggaaggagtg；PrimerTUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；以TUBB3-5HA为模板，设计PrimerTUBB3-1-longnew和PrimerTUBB3-2为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段的TUBB3-5HA-long；PrimerTUBB3-1-longnew：cgggctgcagcgaccaatgtggggatgtggtgcggaaggagtg；PrimerTUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计PrimerTUBB3-5和PrimerTUBB3-6-short为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-3HA；PrimerTUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；PrimerTUBB3-6-short：actgtggagggctgggcagtc；以得到的TUBB3-3HA为模板，设计PrimerTUBB3-6-longnew和PrimerTUBB3-5为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段TUBB3-3HA-long；PrimerTUBB3-6-longnew：gataagcttgatatccactgtggactgtggagggctgggcagtc；PrimerTUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；以mRFP序列为模板，设计PrimerTUBB3-3和PrimerTUBB3-4为引物，通过PCR反应得到与TUBB3-5HA-long有重叠的DNA片段TagRFP；PrimerTUBB3-3：cggaggcccagggccccaagagggcaaagagggccacgaacttctctctgttaaagc；PrimerTUBB3-4：cactccagctgcgagcagctctatcaattaagtttgtgccccag；取纯化的pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long片段混匀，通过Gibson克隆试剂盒制备得到pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA靶向载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；（2）构建sgRNA导向载体设计如下结构的序列1和序列2混匀，高温加热，退火后与pBS-U6-sgRNA载体连接，制备得到pBS-U6-TUBB3-sgRNA导向载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；序列1：CACCGGTACATCTCGCCCTCTTCCT；序列2：AAACAGGAAGAGGGCGAGATGTACC；（3）构建携带EGFP报告基因的Cas9表达载体取如SEQIDNo.6所示核苷酸序列结构的IRES-EGFP序列亚克隆到pCAG-Cas9-bpA载体中的Cas9片段的下游，构建得到pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表达载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；（4）制备hiPSCs单细胞悬液取Targetvector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA混匀，在lipofectamine3000的介导下共转染至hiPSCs，制备得到hiPSCs单细胞悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：张京钟，余爽，
申请(专利权)人：金睿德生物医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32