灌注培养方法及其用途技术

本发明专利技术提供培养哺乳动物细胞的方法和利用这些培养方法的多种方法。还提供多孔细胞培养板用于例如灌注培养方法中。

Perfusion culture method and use thereof

The present invention provides methods for culturing mammalian cells and a variety of methods for utilizing these cultures. A porous cell culture plate is also provided for example in a perfusion culture method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】灌注培养方法及其用途相关申请的交叉引用本申请要求保护2014年6月6日提交的美国临时专利申请系列号62/009,058的优先权，其全部内容在本文通过提述并入。
本专利技术涉及分子生物学方法、细胞培养工艺开发方法和重组蛋白的制造方法。背景含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞经常用于生产治疗上或商业上重要的蛋白质。虽然数种高通量(highthroughput，HT)的细胞培养系统已在生物技术工业中用于补料分批方法数年，但是没有已知存在的使用多孔板用于基于灌注的细胞培养的HT模型。概述本专利技术(至少部分上)基于如下发现：在多孔板中以本文描述的具体方式培养哺乳动物细胞导致实质性改进的活细胞密度和重组蛋白产生，并提供了大规模灌注、生产生物反应器中培养表现的精确模型。鉴于这一发现，本文提供培养哺乳动物细胞的方法、产生重组蛋白的方法和用于测试制备重组蛋白的制造工艺的方法。还提供多孔细胞培养板系统，其能够用于例如实施任何本文所述的方法。本专利技术提供培养哺乳动物细胞的方法，其包括：提供多孔板，所述多孔板包含至少一个含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；和在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。在这些方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的一些实施方案中，所述CHO细胞含有编码重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸。还提供产生重组蛋白的方法，其包括：提供多孔板，所述板包含至少一个包含置于第一液体培养基中的一哺乳动物细胞的孔，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；和从所述哺乳动物细胞或从所述第一或第二培养基回收所述重组蛋白。在这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳动物细胞。在这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述第一或第二液体培养基。还提供用于测试用于制备重组蛋白的制造工艺的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一个包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中的所述重组蛋白；和将所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中存在的重组蛋白的量与重组蛋白的参考水平进行比较。在这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白的参考水平是使用不同的培养方法产生的重组蛋白的水平。在这些方法的一些实施方案中，所述不同培养的方法利用不同的第一或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平或不同的多孔板。在这些方法的一些实施方案中，所述不同的培养方法利用不同的原材料、抗结块剂或化学上限定的液体培养基。在一些实施方案中，这些方法用于例如进行高通量细胞培养实验来执行实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QDB)研究。在这些方法的一些实施方案中，在所述第一或第二液体培养基中检测所述重组蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)。在这些方法的一些实施方案中，在所述细胞中检测所述重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述第一体积的第一液体培养基基本上不含哺乳动物细胞。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述第一液体培养基占据约10％至约60％的孔体积。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述旋转搅拌为约320RPM至约400RPM。在本文描述的任何方法中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基同时进行。在本文描述的任何方法中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基连续或周期性进行。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积随时间增加。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，将所述多孔板温育超过7天的一段时间，并且在温育的第1至3天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约50％；在培养的第4至6天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约40％至约70％；并且从培养的第7天起的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约90％至约150％。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述孔具有约1mL至约18mL的体积(例如，约1mL至约7mL或约1mL至约3.5mL)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是深孔板(deep-wellplate)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中所述孔的底部直径为约6.0mm至约35mm(例如，约12mm至约50mm)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述孔的高度为约12mm至约50mm。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约15mL(例如，约150μL至约10mL，约150μL至约5mL或约150μL至约150μL)的第一培养基中。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上限定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质培养基。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在约最初的24至48小时的时间段之后，在每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约150％。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在去除所述第一体积的第一液体培养基之前，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并以约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；和在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基，并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 US 62/009,0581.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并以约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；和在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基，并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。3.权利要求2的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。4.权利要求3的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。5.一种产生重组蛋白的方法，该方法包括：提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；在约31℃至约40℃并以约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；和从所述哺乳动物细胞或从所述第一或第二培养基回收所述重组蛋白。6.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白回收自所述哺乳动物细胞。7.权利要求6的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。8.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白回收自所述第一或第二液体培养基。9.权利要求8的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。10.一种用于测试用于制备重组蛋白的制造工艺的方法，所述方法包括：提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中的重组蛋白；和将所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中存在的重组蛋白的量与重组蛋白的参考水平进行比较。11.权利要求10的方法，其中所述重组蛋白的参考水平是使用不同的培养方法产生的重组蛋白的水平。12.权利要求11的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的第一或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平或不同的多孔板。13.权利要求11的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的原材料、抗结块剂或化学上限定的液体培养基。14.权利要求10的方法，其中所述方法用于实施高通量细胞培养实验来执行实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QBD)研究。15.权利要求10的方法，其中在所述第一或第二液体培养基中检测所述重组蛋白。16.权利要求15的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。17.权利要求10的方法，其中在所述细胞中检测所述重组蛋白。18.权利要求17的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。19.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基基本上不含哺乳动物细胞。20.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述第一液体培养基占据约10％至约60％的孔体积。21.权利要求5或10的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。22.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述旋转搅拌为约320RPM至约400RPM。23.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基同时实施。24.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基连续实施。25.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基周期性实施。26.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积随时间增加。27.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中：将所述多孔板温育超过7天的时间段，并且在温育的第1至3天中的每24小时时段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约50％；在培养的第4至6天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约40％至约70％；并且从培养的第7天起的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约90％至约150％。28.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有约1mL至约18mL的体积。29.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有约1mL至约7mL的体积。30.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有约1mL至约3.5mL的体积。31.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。32.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板是深孔板。33.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔的底部直径为约6.0mm至约35mm。34.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔的高度为约12mm至约50mm。35.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约15mL的第一培养基中。36.权利要求35的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·维利格奥伯贝克，J·杨，Y·杨，G·罗恩佐，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：美国,US