MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用，该重组细胞以HEK293细胞为宿主细胞，转染包含MrgprX2全长基因的表达载体，其细胞膜上能够稳定表达MrgprX2受体大分子，而且具有完整的受体生物活性。该MrgprX2高表达膜受体固定相由活化硅胶吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜制成，可应用于特异性筛选识别由MrgprX2引发的类过敏组分。本发明专利技术通过实际应用发现盐酸青藤碱可以特异性与MrgprX2相结合，同时细胞水平的过敏实验表明盐酸青藤碱均可以刺激肥大细胞释放组胺和β氨基己糖苷酶，证实MrgprX2高表达膜受体固定相确实可以应用于特异性识别类过敏组分。

【技术实现步骤摘要】
MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及MrgprX2高表达的重组细胞及基于该重组细胞特异性识别类过敏组分的MrgprX2高表达膜受体固定相及其构建方法和应用。
技术介绍
随着中药临床应用的日益增长，中药安全性“事件”时有发生，尤其是中药注射剂的临床安全性问题倍受关注。类过敏反应又称为假过敏反应，是外源刺激物直接刺激肥大细胞，导致其释放组胺类活性递质，类过敏反应一般不由IgE介导，在患者首次用药即可产生。研究证明类过敏刺激物所激活的G蛋白为MRGPRS(MAS-RelatedGProtein-CoupledReceptors)，而MrgprX2(Mas-relatedGPRfamilymemberX2)主要分布在人肥大细胞表面，且该类受体不依赖IgE，其可能是基础促分泌素的受体，可直接介导肥大细胞活化，诱导肥大细胞脱颗粒。约翰霍普金斯大学研究人员确定MrgprX2受体将是解决药物过敏反应的极其重要的靶点。细胞膜色谱技术是一种有效的从复杂体系中直接筛选识别目标组分的新技术。目前还没有能够特异性识别类过敏组分MrgprX2高表达膜受体固定相的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用，以构建的MrgprX2高表达的重组细胞为基础，进一步构建出MrgprX2高表达膜受体固定相，能够用于筛选作用于MrgprX2的类过敏组分。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现：一种MrgprX2高表达的重组细胞，所述重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含MrgprX2全长基因的表达载体。所述MrgprX2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述包含MrgprX2全长基因的表达载体是LV5-MrgprX2homo慢病毒。基于所述的MrgprX2高表达的重组细胞的MrgprX2高表达膜受体固定相，所述MrgprX2高表达膜受体固定相是由活化硅胶吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜制成的。所述的MrgprX2高表达膜受体固定相的制备方法，包括以下步骤：1)制备细胞膜混悬液将培养好的MrgprX2高表达的重组细胞离心、清洗，然后在冰浴条件下，将MrgprX2高表达的重组细胞超声破碎，通过差速离心除去细胞器，分离出细胞膜，再将细胞膜用生理盐水重悬，制得细胞膜混悬液；2)制备MrgprX2高表达膜受体固定相将硅胶活化后置于具支试管中，真空条件下，向具支试管中加入步骤1)制得的细胞膜混悬液，涡旋振荡，然后静置过夜，得到MrgprX2高表达膜受体固定相。所述的MrgprX2高表达膜受体固定相在筛选以MrgprX2为靶点的类过敏组分方面的应用。所述MrgprX2高表达膜受体固定相经湿法装柱后制得用于识别作用于MrgprX2的类过敏组分的细胞膜色谱柱，利用该细胞膜色谱柱筛选识别以MrgprX2为靶点的类过敏组分。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术将包含MrgprX2全长基因的表达载体转染入HEK293宿主细胞，并经过筛选，获得了稳定的MrgprX2高表达的重组细胞，记为HEK293-MrgprX2细胞。本专利技术构建的包含MrgprX2基因全长的重组HEK293-MrgprX2细胞的细胞膜能够稳定的表达MrgprX2分子，最高表达MrgprX2受体量较转染前提高5000倍，而且具有完整的分子活性。2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而重组后的HEK293-MrgprX2细胞的MrgprX2配体的相对表达量比HEK293明显增高，相对于其他细胞表面分子占据表达优势地位，在结合MrgprX2受体方面处于有利地位；这样就大大提高了筛选以MrgprX2为靶点药物的灵敏性及特异性；同时能为进一步研究MrgprX2生物学特性提供较好的细胞模型。3、本专利技术提供的用于特异性识别类过敏组分的MrgprX2高表达膜受体固定相，是在载体活化硅胶中吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜而制成的，具有表达特定MrgprX2的膜受体，MrgprX2受体为能够与类过敏组分特异性结合的受体。在细胞膜色谱柱中填充MrgprX2高表达膜受体固定相可以提高复杂样品中“类过敏组分”筛选的特异性，能够针对复杂样品中的“类过敏组分”进行特异性的识别，提升分析效率，对提高筛选效率、阐明作用机理具有重要的意义。4、本专利技术提供的MrgprX2高表达膜受体固定相的制备方法，将MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜分离出来，加入活化硅胶中，使活化硅胶吸附细胞膜，即得到MrgprX2高表达膜受体固定相。该方法工艺简单，操作方便。进一步的，将制得的MrgprX2高表达膜受体固定相湿法装柱后，还可制得用于识别作用于MrgprX2的类过敏组分的细胞膜色谱柱，便于进行复杂样品中类过敏组分的筛选。5、运用本专利技术构建的MrgprX2高表达膜受体固定相筛选盐酸青藤碱，发现盐酸青藤碱在MrgprX2高表达膜受体固定相可发生保留，保留时间为35min左右，说明盐酸青藤碱可与MrgprX2结合。通过体外实验发现盐酸青藤碱可以刺激肥大细胞发生脱颗粒反应，释放β氨基己糖苷酶及组胺等过敏介质。因此上述结果表明MrgprX2高表达膜受体固定相可以应用于以MrgprX2为靶点的药物引发类过敏组分的筛选。附图说明图1为LV5-MrgprX2homo慢病毒感染效率图；其中a为NC-HEK293细胞(感染LV5-NC病毒的HEK293细胞)明场图；b为NC-HEK293细胞荧光图；c为MrgprX2-HEK293细胞明场图；d为MrgprX2-HEK293细胞荧光图。图2为嘌呤霉素筛选的阳性细胞培养图；其中a为MrgprX2-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后生长状态图；b为MrgprX2-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后阳性细胞生长图；c为NC-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后生长状态图；d为NC-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后阳性细胞生长图。图3为mRNA水平MrgprX2表达水平的RT-PCR检测图；图4为蛋白水平MrgprX2蛋白的Westernblot检测图；图5为钙成像监测胞内钙流浓度变化图；其中a为A+P作用于HEK293细胞；b为A+P作用于NC-HEK293细胞；c为A+P作用于MrgprX2-HEK293细胞；d为C48/80作用于HEK293细胞；e为C48/80作用于NC-HEK293细胞；f为C48/80作用于MrgprX2-HEK293细胞。图6为盐酸青藤碱在MrgprX2高表达细胞膜色谱柱上的色谱图；图7为盐酸青藤碱刺激肥大细胞释放组胺。图8为盐酸青藤碱刺激肥大细胞释放β氨基己糖苷酶。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步详细说明。本专利技术在构建MrgprX2全长基因的真核表达载体LV5-MrgprX2慢病毒的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定的MrgprX2高表达的重组细胞，将其记为HEK293-MrgprX2细胞，并以HEK293-MrgprX2细胞为基础制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MrgprX2高表达的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含MrgprX2全长基因的表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种MrgprX2高表达的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含MrgprX2全长基因的表达载体。2.如权利要求l所述的MrgprX2高表达的重组细胞，其特征在于：所述MrgprX2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。3.如权利要求1所述的MrgprX2高表达的重组细胞，其特征在于：所述包含MrgprX2全长基因的表达载体是LV5-MrgprX2homo慢病毒。4.基于权利要求1-3中任意一项所述的MrgprX2高表达的重组细胞的MrgprX2高表达膜受体固定相，其特征在于：所述MrgprX2高表达膜受体固定相是由活化硅胶吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜制成的。5.权利要求4所述的MrgprX2高表达膜受体固定相的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺浪冲，张涛，韩省力，马维娜，曹娇，贺怀贞，刘瑞，车德路，吕艳妮，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61