本发明专利技术涉及一种生物技术领域的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，包括如下步骤：构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；取步骤一所述的融合表达载体，表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导，得到免疫毒素。本发明专利技术的方法只需要制备不同的导向部分多肽以及毒性部分多肽，就可以将其进行组合，进而产生可以针对不同靶点及拥有不同毒性机制的免疫毒素，具有显著的多样性及灵活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
的药用重组蛋白的合成方法，具体地讲，涉及一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法。
技术介绍
免疫毒素是一种融合蛋白，包含导向多肽部分，毒性多肽部分，和/或接头多肽部分。自从单克隆抗体于1957年被Kohlor应用杂交瘤技术首次制备出来，其就在医学研究以及疾病的临床诊断和治疗领域展示出了广阔的应用前景。长期以来，人们致力于利用单克隆抗体治疗多种疾病，例如肿瘤、自身免疫疾病等等，然而单独使用单克隆抗体的效果有时并不理想。为了达到更有效的治疗效果，人们将一些具有细胞毒性的蛋白与单抗结合，形成了具有选择性杀伤与之相结合的细胞的“免疫毒素”，为疾病的靶向治疗的弹药库装备了新的弹药。免疫毒素(immunotoxins,ITs)是指将具有导向功能的蛋白与毒素蛋白相结合而产生的一种蛋白分子。其中具有导向性功能的部分主要负责引导免疫毒素蛋白分子与靶细胞的特异性结合，而毒素蛋白部分则主要是起到对细胞进行杀伤的作用。从免疫毒素发展演变的进程来看，免疫毒素的制备生产主要有化学偶联法和重组表达法两大类。化学偶联法制备免疫毒素首先需要单独制备抗体和毒素，随后通过化学偶联的方式将二者相连而制得免疫毒素。化学偶联法的偶联效率低，生产成本较高，且由于蛋白上可能发生偶联反应的位点众多而导致产品均一性差，另外偶联的化学键在体内循环时倾向于降解，使得裸毒素泄露而导致非特异性毒性，有较大的毒副作用风险，而降解产生的裸抗体则可能封闭抗原，使得治疗效果不佳。而随着基因工程的发展，使得免疫毒素的制备生产进入了新的时代。人们利用基因重组技术将编码导向功能多肽的基因与编码毒素多肽的基因相融合并在适当的表达系统中进行表达。采用这一技术方案生产的免疫毒素我们可以称之为基因工程免疫毒素，它相比化学偶联法制造的免疫毒素而言在产品均一性和稳定性上有了大幅提高，并且使得大量生产免疫毒素成为可能。但基因工程法生产免疫毒素也有其局限性：融合基因被限制在单一宿主中进行表达，而构成
免疫毒素的导向部分和毒性部分往往需要不同的宿主表达环境这一矛盾往往导致采用单一的宿主表达目的免疫毒素不能获得很好的产量、收率、纯度以及随之而来的成本的提高。例如目前多采用大肠杆菌表达系统表达单链抗体免疫毒素，由于免疫毒素的导向部分在大肠杆菌表达系统中不能很好的折叠而往往形成包涵体，而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，一般来说，蛋白质的复性效率在20％左右；而毒素蛋白对真核细胞具有致命毒性，若采用真核表达系统则可能对宿主细胞产生毒害，但是也有研究人员对利用真核表达系统表达免疫毒素做了大量的工作，如专利CN1863921公开了一种在毕赤酵母以及EF-2突变型毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，虽然采用分泌表达的方式在毕赤酵母以及EF-2突变型(毒素免疫型)毕赤酵母表达系统中成功表达了免疫毒素，较长的发酵周期获得的较低的产量相比于原核表达系统而言并不具备竞争力，且毒素蛋白上的糖基化位点可能被宿主进行糖基化修饰，有可能引入产品不均一性；文献披露了一种在EF-2突变型的CHO细胞中表达免疫毒素的方法，该方法同样遭遇了表达量低下、发酵周期长、成本高昂以及潜在的糖基化的风险(Protein expression and purification,2000,19(2):304-311)。内含肽是指存在于前体蛋白当中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自剪接功能将内含肽两端的外显肽以肽键连接，同时将自身从前体蛋白中释放出来。内含肽从结构和功能上可以分割为N端和C端，当N端或C端单独存在时不能发生剪接反应，而只有当N端和C端在适合剪接的条件下接触时才能发生剪接反应。断裂内含肽可以是人为地将连续内含肽从适当位置断开成两个多肽片段，也可以是天然存在的。天然断裂内含肽是一类由两个分别转录和表达的基因编码的两个多肽片段，这些断裂内含肽在接触时会自组合并以反式剪接方式催化外显肽的连接。内含肽在生物技术应用中应用广泛，包括使用内含肽的剪接活性介导蛋白质连接(intein-mediated protein ligation,IPL)、蛋白质环化、蛋白质标记、毒性蛋白表达、引入非天然氨基酸、研究体内蛋白质互作等。利用内含肽及其变体介导蛋白质纯化并在大规模蛋白质生产中应用也日益受到关注。因此，本领域需要提供一种通用、易于操作、成本低廉获取融合免疫毒素的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法。本专利技术克服现有的利用化学偶联或融合表达方法制备免疫毒素技术中产品不均
一、操作步骤多、目的蛋白对表达宿主有毒性等等不足，提供一种分别制备具有导向功能的多肽和具有细胞毒性的多肽并利用内含肽的反式剪接功能将其连接在一起，从而得到免疫毒素的方法。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术涉及一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，所述方法包括如下步骤：步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；其中，所述含有内含肽N端的融合表达载体与含有内含肽C端的融合表达载体所表达的多肽需成对存在，以使得反式剪接反应能够发生；步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；步骤三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导免疫毒素的导向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分进行反式剪接，得到免疫毒素。优选地，步骤一中，所述内含肽为人工断裂内含肽、或天然断裂内含肽，或具有剪接功能的内含肽突变体。优选地，步骤一中，所述内含肽为Ssp DnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE。优选地，步骤一中，所述内含肽N端的C末端或C端的N末端还融合有功能性多肽。优选地，所述功能性多肽为MBP或ChBD标签蛋白。优选地，步骤一中，所述融合表达载体的构成为导向功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-导向功能多肽，或导向功能多肽-内含肽N端-功能多肽、或功能多肽-内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端-功能多肽、功能多肽-内含肽C端-导向功能多肽。优选地，步骤一中，所述具有导向功能的多肽为抗体、单链抗体scFv、二硫键稳定抗体dsFv、二硫键稳定单链抗体dsscFv、Fab抗体、细胞因子、或生长因子。优选地，步骤一中，所述具有毒性功能的多肽为RIP型毒素；具体为蓖麻毒素、ADP核糖基化免疫毒素，白喉毒素、或绿脓杆菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的突变体。优选地，步骤二中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、高扩酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、酵母、中国仓鼠卵巢细胞、或人肾胚细胞。优选地，步骤三中，还包括分离纯化进而获得免疫毒素的步骤。优选地，所述分离纯化的方法为亲和层析方法、离子交换层析方法、或疏水作用层析方法。优选地，步骤三中，所述反式剪接条件为能够触发指定内含肽完成自剪接的条件。优选地，当内含肽为Npu D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；其中，所述含有内含肽N端的融合表达载体与含有内含肽C端的融合表达载体所表达的多肽需成对存在，以使得反式剪接反应能够发生；步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；步骤三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导免疫毒素的导向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分进行反式剪接，得到免疫毒素。
【技术特征摘要】
1.一种基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一，构建表达免疫毒素中具有导向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的载体DNA片段，将所述两种多肽的载体DNA片段与内含肽的N端或C端分别连接，形成融合表达载体；其中，所述含有内含肽N端的融合表达载体与含有内含肽C端的融合表达载体所表达的多肽需成对存在，以使得反式剪接反应能够发生；步骤二，取步骤一所述的融合表达载体，分别在合适的宿主细胞中进行表达，得到融合内含肽N端的融合多肽A以及融合内含肽C端的融合多肽B；步骤三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在内含肽对应的反式剪接条件下，诱导免疫毒素的导向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分进行反式剪接，得到免疫毒素。2.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述内含肽为人工断裂内含肽、或天然断裂内含肽，或具有剪接功能的内含肽突变体。3.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述内含肽为Ssp DnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE。4.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述内含肽N端的C末端或C端的N末端还融合有功能性多肽。5.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，所述功能性多肽为MBP或ChBD标签蛋白。6.根据权利要求1所述的基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法，其特征是，步骤一中，所述融合表达载体的构成为导向功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端、或内含肽C端-导向功能多肽，或导向功能多肽-内含肽N端-功能多肽、或功能多肽-内含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-内含肽N端-功能多肽、功能多肽-内含肽C端...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊生，朱建伟，韩雷，丁凯，谢跃庆，江华，路慧丽，张宝红，张蕾，
申请(专利权)人：上海交通大学，美国杰科实验室有限公司，杰科天津生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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