本发明专利技术属于基因工程领域，具体为针对c‑Myc标签的单域重链抗体(又称纳米抗体)，其具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和性、特异性、稳定性等)更好的突变体，该高特异性的纳米抗体可作为针对c‑Myc的免疫亲和吸附材料，对含有c‑Myc标签的重组蛋白进行纯化。
Anti C immune Myc tag single domain antibody affinity adsorption materials based on
The invention belongs to the field of gene engineering, in particular to a single domain heavy chain antibody to C Myc label (also called nano antibody) which has SEQ, ID: NO. amino acid sequence shown in figure 1. The amino acid sequence provided by the invention can be used as the precursor, through alteration or random mutagenesis, can obtain the properties (affinity, specificity and stability) better mutants, nano antibody of the high specificity can be used for C Myc immune affinity adsorption material, the recombinant protein containing C Myc the label was purified.
【技术实现步骤摘要】
基于抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料
本专利技术涉及一种基于单域重链抗体(又称纳米抗体技术)的免疫亲和吸附材料，特别是针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料。技术背景c-Myc标签蛋白的发现源于1985年Evan制备获得了一株针对人原癌基因产物Myc蛋白的单克隆抗体9E10，此后研究发现该抗体识别的表位由10个氨基酸残基组成，其序列为Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，并且这10个氨基酸与其它蛋白融合表达后依然能够保持很强的抗原活性，可以被相应抗体识别，而且不受到蛋白框架的影响。因此，c-Myc标签系统广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化以及蛋白质工程等领域。免疫亲和层析、免疫亲和磁珠及免疫共沉淀等技术常用于分离纯化含有c-Myc标签融合蛋白。这类亲和纯化技术基于配基与c-Myc标签特异性结合的原理，一般地，将特异性结合c-Myc标签的配基与载体偶联或吸附，然后用于从溶液中特异性吸附c-Myc标签融合蛋白。市场上针对c-Myc标签融合蛋白纯化用的亲和柱和亲和磁珠，偶联的配基大都是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体的研发和生产过程较为繁琐和复杂，多克隆抗体来源有限。现有的针对c-Myc标签融合蛋白纯化的亲和柱和亲和磁珠价格普遍偏高。而纳米抗体可以在大肠杆菌、酵母等生物中大量表达，有利于降低相关制品的生产成本。蛋白纯化过程中需要用到酸或碱性溶液对目的蛋白进行洗脱。由于单克隆抗体或多克隆抗体由重链和轻链组成，酸碱洗脱会不可避免的导致抗体活性降低，因而不能重复使用。相比之下，单域重链抗体仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温。本专利技术中提供的亲和吸附材料可重复多次使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单域重链抗体，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别c-Myc标签。所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变技术进行改造所获得的能与c-Myc标签特异性结合的抗体。所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。上述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为：所述载体为磁珠时，制备方法为：取1mg羧基磁珠于离心管中，加入600～1000μl活化缓冲液(10mM，NaH2PO4，pH6.0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入1～5mg碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后，静置35min。用偶联缓冲液(10mM，Na2HPO4，pH7.4)洗涤磁珠5遍，加入抗c-Myc标签单域重链抗体，室温反应3～5h，得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫磁珠；所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用0.1MHCl洗涤10～20次，每次平衡6～10min。用偶联缓冲液(10mM，Na2HPO4，pH7.2)洗涤5～20次，加入抗c-Myc标签单域重链抗体，室温反应3～10h，得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料；所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液(PBS，10mM，pH6.5)交替洗涤5～15次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入抗c-Myc标签单域重链抗体，混匀，加入终浓度1～10mg/ml的碳二亚胺(EDC)，迅速混匀，4℃搅拌反应12～20h，得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。将上述免疫亲和吸附材料(载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球)装填至层析柱，即得到c-Myc标签免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量，取适量上述免疫亲和吸附材料于层析柱，加入8～10倍柱床体积的PBS(10mM，pH7.2)洗涤后，4℃，保存于20％乙醇溶液。本专利技术还涉及装载有权利要求1所述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的亲和层析柱。上述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的应用，用所述c-Myc标签免疫亲和吸附材料对样品中含c-Myc标签的蛋白进行纯化。当免疫吸附材料的载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球时，方法为：首先用PBS(10mM，pH7.2)洗涤免疫吸附材料，加入样品提取液，然后用纯水淋洗，再用甘氨酸盐酸(pH2.2)洗脱特异性吸附的含c-Myc标签重组蛋白，收集的洗脱液，纯化后的样品提取液，可用于后续分析检测。当载体为磁珠时，方法为：将免疫磁珠加入纯水中，磁力架回收磁珠，重复清洗3～5次，然后将免疫磁珠加入样品提取液中，混匀，磁力架回收磁珠，纯水清洗3～5次后，用甘氨酸盐酸(pH2.2)洗脱特异性吸附的c-Myc标签重组蛋白，收集的洗脱液，即为纯化后的样品提取液，可用于后续分析检测。本专利技术针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料配基为单域重链抗体，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列，该配基可特异性识别c-Myc标签。该单域重链抗体容易获得，耐热，可以通过生物学方法大量培养生产配基为单域重链抗体，避免了人工抗体等繁琐生产方法，大大降低了生产成本，并且可重复使用，应用前景广阔。具体实施方式下面通过c-Myc标签免疫亲和吸附材料的制备及应用，对本专利技术做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本专利技术的应用范围。实施例1：抗c-Myc标签单域重链抗体(即针对c-Myc标签的单域重链抗体)免疫文库的构建将c-Myc标签与牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)共价偶联，得到c-Myc人工抗原c-Myc-BSA，取300μgc-Myc-BSA与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼(Lamapacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μgc-Myc-BSA与弗氏不完全佐剂乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA为模板，oligodT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因(采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA，反应条件为，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20个循环，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。将第一轮PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，进行扩增，反应条件为，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5个循环，98℃，10s，68℃，40s，30个循环，72℃延伸10min。经DNA片段回收试剂盒回收、定量，于-20℃保存备用。将噬菌粒pHEN1和PCR扩增产物分别用SfiI、NotI双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后，以1∶3摩尔比，在16℃，过夜连接。表1文库构建及鉴定所用的引物注：下划本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种c‑Myc标签免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以特异性识别c‑Myc标签的单域重链抗体作为配基，所述特异性识别c‑Myc标签的单域重链抗体具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种c-Myc标签免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以特异性识别c-Myc标签的单域重链抗体作为配基，所述特异性识别c-Myc标签的单域重链抗体具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的c-Myc标签免疫亲和吸附材料，其特征在于，所述配基为在SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列基础上通...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂追，付金衡，吴红静，许杨，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36
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