一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法。此外，本发明专利技术提供编码所述异源多聚体蛋白A突变体的核苷酸文库和对应的蛋白质文库，揭示了从所述突变体文库中筛选对预定靶分子具有结合能力的蛋白A突变体的方法，分离编码所述蛋白A突变体的核苷酸的方法，鉴定和分析所述蛋白A突变体的方法，以及生产所述蛋白A突变体的方法。本发明专利技术的方法具有产生更高结合能力的特异性结合蛋白的优点。

Method for preparing binding protein based on protein A mutant

The present invention relates to a method for preparing binding proteins based on protein A mutants. In addition, the invention provides a library of protein nucleotide library encoding the heterologous multimers of A mutants and corresponding to the predetermined target for screening has revealed the molecular method of binding protein A mutant ability from the mutant library, the method of separation encoding protein A mutant nucleotide, identification and analysis method the A mutant protein, and method of production of the mutant protein A. The method of the present invention has the advantages of producing a specific binding protein with a higher binding capacity.

【技术实现步骤摘要】
一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法
本专利技术涉及制备具有新的特异性结合能力的异源多聚体蛋白A突变体的方法。本专利技术提供编码所述异源多聚体蛋白A突变体的核苷酸文库和对应的蛋白质文库，揭示了从所述突变体文库中筛选对预定靶分子具有结合能力的蛋白A突变体的方法，分离编码所述蛋白A突变体的核苷酸的方法，鉴定和分析所述蛋白A突变体的方法，以及生产所述蛋白A突变体的方法。此外，本专利技术进一步提供能以高亲和力特异性结合到预定靶分子上的、以异源多聚体蛋白A为基础的新的结合蛋白质。
技术介绍
抗体能够特异性识别和结合各类外源性物质，如小分子化合物、花粉、病毒、细菌等半抗原和抗原。在抗体分子Y型的两个分叉顶端，各有一个由六条环状多肽构成的互补区域(CDR)形成锁状结构，这些部位的氨基酸通过氢键、范德华力、电荷作用和疏水作用，与抗原表面的表位形成非共价键相互作用。在抗体基因中，编码抗原结合部位的DNA可以随机组合和突变，这一高变区的氨基酸可以发生非常丰富的变化，每一种特定的变化，可以赋予抗体具有和某一预定抗原相结合的能力。随着基因重组技术、蛋白质工程和重组抗体库体外亲和筛选技术以及结构生物学的发展，越来越多的抗体三维晶体结构得到解析，抗体结合抗原的分子机理得到更好理解。抗体的局限性，比如分子量大、结构复杂等，促使研究者将来源于抗体CDR区域的“结合区域”这一概念，移植到一些非常稳定的非抗体类的蛋白(如本专利技术用到的异源多聚体蛋白A)表面。将这些蛋白表面的某些邻近的氨基酸高度突变，可以人为的塑造出适当的结合区域，从而赋予这些蛋白与各类预定靶分子结合的能力。WO95/19374描述了以蛋白A的一个结构域单体为基础的结合蛋白(Affibody)的产生。蛋白A是来源于金黄色葡萄球菌细胞表面的一种蛋白质，由5个高度同源的结构域组成，其结合许多哺乳动物物种(包括人)的免疫球蛋白。由于蛋白A单个结构域的分子量非常小(约6kDa)，其表面能提供的结合区域的面积相对较小，限制了其结合能力。根据已有技术信息，WO95/19374中产生的结合蛋白的亲和力KD范围通常在10-6-10-8M范围，多数情况下在10-7M，例如初筛得到的结合EGFR的结合蛋白的亲和力在130nM-185nM，结合H-Ras的结合蛋白的亲和力在79nM-283nM，结合rVIII的结合蛋白的亲和力在100nM-200nM。在此外，蛋白A单个结构域的结合区域由两个并列的α螺旋一侧的氨基酸构成，形成了一个扁平的结合面，这也限制了其能结合的靶分子表位的类型。
技术实现思路
本专利技术的目标是提供具有更高结合能力的、能够普遍的识别更多不同类型的靶分子表位的多聚体蛋白A突变体的方法。本专利技术的进一步目标是提供以新颖的异源多聚体蛋白A为基础，通过初始筛选，即可普遍制备高亲和力结合蛋白的方法。更具体地，本专利技术提供了一种制备具有新的特异性结合能力的异源多聚体蛋白A突变体的方法，包括下列主要步骤：提供单体经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的库，所述库包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的蛋白A单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少两个所述单体是通过对位于SEQIDNo：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换而进行的修饰，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；为所述经过修饰的蛋白A的库提供潜在的靶分子；使所述修饰的蛋白质的库与所述靶分子接触；通过筛选方法得到异源多聚体蛋白A突变体。用于该申请中重要的术语的定义术语“蛋白A单体”是指蛋白A的一个结构域蛋白，包括与SEQIDNO:1完全一致的，或者氨基酸序列一致性超过80％的蛋白质。本说明书中，术语“异源多聚体蛋白”是包含两个或更多不同修饰的蛋白A单体的蛋白质。因此，本专利技术的“异源多聚体”具有两个独立的结合区域的至少两个不同修饰的蛋白A单体的融合蛋白，优选为异源二聚体或异源三聚体。根据本专利技术，由至少两个不同的蛋白A修饰蛋白所组成的异源多聚体结合蛋白能结合预定抗原。其中的蛋白A修饰蛋白可以通过多种方式组合在一起，形成“头尾相接”的融合蛋白，例如基因融合等。这种融合可以使多个不同的蛋白A修饰蛋白上的结合区域能够组合起来，形成一个大的、整体性的结合区域。这种融合，类似于抗体可变区的多个CDR区域组合起来，共同形成了抗体结合部位。对应的，多个不同的蛋白A修饰蛋白上的结合区域，能够分别结合到同一特定抗原的不同部位，这些部位组合起来，共同形成了抗原表位。术语“头尾相接的融合”描述了把多个不同的蛋白A修饰蛋白连接起来形成融合蛋白的形式。把多个不同的蛋白A修饰蛋白按照(氨基端-羧基端)—(氨基端-羧基端)n的连接方向，连接起来形成异源多聚体融合蛋白，这里n取决于需要连接起来的蛋白A修饰蛋白的数量。在这种头尾相接的连接形式中，相邻的两个蛋白A修饰蛋白可以直接连接在一起，也可以通过柔性连接多肽，比如，氨基酸序列为SGGGG的连接多肽，或者其他连接多肽，比如KPEVIDASELTPAVT，GGGGS等。其他通常用于基因融合的连接多肽也可以在这里使用。总之，异源多聚体可以通过把两个或多个不同的蛋白A修饰蛋白，通过首尾相接的方式连接在一起，形成一个由两个及两个以上的蛋白A修饰蛋白组成的融合蛋白。通过柔性多肽将两个或多个蛋白A修饰单体上的结合区域连接起来，所述的两个或多个结合区域具有了更多的构象，提供了识别更多类型的靶分子表位的可能性。术语“群”或者“库”、“文库”特指由经过不同修饰的蛋白A的异源多聚体突变体混合而得到的集合。编码所述经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的DNA的混合也被成为核苷酸群。术语“群”或者“库”、“文库”都是同义的且能互换使用。本专利技术所述的“特异结合区”表示：形成聚合物的各蛋白A单体之间，突变位点由于电荷、空间结构和侧链的疏水性/亲水性等原因，突变的氨基酸与周围的环境相互作用，形成一个连续的表面暴露区域，该连续区域能够和预定靶分子特异性结合，该环境可以是溶剂，一般是水，或者其它分子。在本专利技术中，“氨基酸修饰”是指氨基酸替换、插入、缺失或者化学修饰；优选氨基酸替换。在具体的实施方式中，氨基酸修饰通过对蛋白A单体的第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换来实现。术语“修饰”或“突变”指使用20种氨基酸的其他任一氨基酸对所选定位置的氨基酸进行替换。这两者都是同义的且能互换使用。上述通过突变产生的蛋白A修饰蛋白所组成的异源多聚体蛋白文库，可以通过噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示或细胞表面展示、酵母展示或细菌表面展示方法，进而通过体外定向筛选的方式，针对任一预定的靶分子进行筛选，使能特异性结合靶分子的异源多聚蛋白A突变体富集，从而得到此类结合蛋白。根据本专利技术，可以通过以下一种或多种方法，确定所述的蛋白A突变体与特定靶分子是否具有可定量的结合能力，比如酶联免疫吸附实验(ELISA)、等离子表面共振(SPR)、免疫荧光光谱(IF)、流式细胞术(FACS)、等温滴定量热法(ITC)和分析离心等。在本专利技术所采用的噬菌体展示方法中，重组蛋白A突变体展示在M13丝状噬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法，包括下列步骤：a)提供单体经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的库，所述库包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的蛋白A单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少两个所述单体是通过对位于SEQ ID No：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换而进行的修饰，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；b)为所述经过修饰的蛋白A的库提供潜在的靶分子；c)使所述修饰的蛋白质的库与所述靶分子接触；d)通过筛选方法得到异源多聚体蛋白A突变体，所述突变体以K

【技术特征摘要】
1.一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法，包括下列步骤：a)提供单体经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的库，所述库包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的蛋白A单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少两个所述单体是通过对位于SEQIDNo：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换而进行的修饰，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；b)为所述经过修饰的蛋白A的库提供潜在的靶分子；c)使所述修饰的蛋白质的库与所述靶分子接触；d)通过筛选方法得到异源多聚体蛋白A突变体，所述突变体以KD范围是10-7-10-12M的亲和力结...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋波，
申请(专利权)人：武汉海沙百得生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42