珍珠母蛋白N16的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种珍珠母蛋白N16的制备方法。该方法在特定的制备环境中构建了N16-pRhis-BL21(DE3)plysS表达体系，利用基因重组法在细菌中表达珍珠母蛋白N16；采用凝胶排阻层析法，分离纯化，获得高纯度的珍珠母蛋白N16。本发明专利技术相对于现有技术具有以下优点：明显提高产量，适于批量生产；且成本低，蛋白纯度高；减少试剂残留，绿色环保。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及珍珠母蛋白N16的基因重组制备方法。
技术介绍
骨质疏松症是指以骨量低及组织微结构退行病变为特征、骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。该病在中老年人群中尤为常见。据国际骨质疏松基金会的统计数据显示，目前全世界约2亿人患有骨质疏松症，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。我国是世界上人口最多的国家，骨质疏松症发病率在65岁以上的人群中高达90％。随着世界人口的增加和平均寿命的提高，骨质疏松症的威胁将越来越大，为社会医疗体系带来沉重的负担。如何防治骨质疏松症已成为是世界性的难题。研究报道，珍珠母蛋白具有促进成骨活性，能促进骨损伤修复，显着提高去卵巢大鼠的骨密度，提高新生鼠颅骨的原代培养细胞和MRC-5(人类胎儿成纤维细胞系)细胞的碱性磷酸酶活性，刺激成骨细胞的分化和产生矿化结节，促进骨形成。珍珠母蛋白具有良好的生物相容性，安全性高。在国内外，珍珠母粉被认为是一种良好的骨组织替代材料。珍珠母移植或透皮注射到动物体内无免疫排斥反应或明显毒副作用。N16是属于珍珠母蛋白，分子量为16kDa，在1999年由Samata等人在珍珠母不溶于水的组分中发现。研究表明，N16能影响碳酸钙结晶的形状。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种珍珠母蛋白N16的基因重组制备方法。该方法包括下述步骤：(1)从马氏珠母贝Pinctadafucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA；根据NCBI数据库N16的基因序列，设计以下引物：N16F(5’-GGAATTCGCTGTCCATTATAAGTGC-3’)，和N16R(5’-CGTTAATTGTCAAACCGTTC-3’)，其中下划线部位碱基分别为NdeI和BamHI限制性内切酶位点；(2)利用PCR法扩增N16基因，反应程序设为90～100℃0.5～2分钟，45～60℃20～60秒，72℃0.5～2分钟，共20～40个循环，最后65～75℃5～15分钟；扩增所得N16基因连接到表达载体pRhisMBP上，并导入BL21(DE3)plysS重组大肠杆菌，用于表达N16蛋白；当BL21(DE3)plysS重组大肠杆菌生长到对数期，加入0.1～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～37℃诱导N16的表达6～16h，收集菌体；(3)将收集的表达菌体在pH＝6.5～8.5的环境下分散在0.01～1MTris-HCl中，超声破碎，离心，弃上清，不溶物以洗涤缓冲液超声溶解，离心，收集不溶物，再以溶解缓冲液室温溶解过夜，离心，取上清，超滤浓缩；以凝胶排阻层析柱对N16进行，收集分液，15％SDS-PAGE检测N16；合并含N16的分液，装入透析袋，以50～150倍体积的0.1～20mM磷酸缓冲液进行去盐复性，得目标产品。所述步骤(3)中的洗涤缓冲液由1～3M尿素、0.01～1MTris和0.1％吐温-20制成，pH为6.5～8.5；所述的溶解缓冲液由7～8M尿素、0.01～1MTris和5～40mMβ-巯基乙醇制成,pH为6.5～8.5；流动相为7～8M尿素、0.01～1MTris,和5～40mMβ-巯基乙醇制成，pH为6.5～8.5。本技术的优选方案：所述步骤(2)反应程序设为95℃1分钟，50℃20秒，72℃1分钟，共25个循环，最后72℃10分钟。扩增所得N16基因连接到表达载体pRhisMBP上，并导入BL21(DE3)plysScompetentEscherichiacoli，用于表达N16蛋白；当BL21(DE3)plysScompetentEscherichiacoli生长到对数期，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，37℃诱导N16的表达16h，收集菌体。将表达菌体分散在20mMTris-HCl(pH7.0)中，超声破碎，离心，弃上清；不溶物以洗涤缓冲液(2M尿素,20mMTris,0.1％吐温-20,pH7.0)超声溶解，离心，收集不溶物，再以溶解缓冲液(8M尿素,20mMTris,40mMβ-巯基乙醇,pH7.0)室温溶解过夜，离心，取上清，超滤浓缩，0.45μm滤膜过滤，以Superdex75柱子进行凝胶排阻层析，分离纯化N16，其中，流动相为8M尿素,20mMTris,40mMβ-巯基乙醇,pH7.0，收集分液，15％SDS-PAGE检测N16；合并含N16分液，装入透析袋(透过分子量限制为6000-8000)，以100倍体积20mM磷酸缓冲液去盐复性，得目标产品。本专利技术与现有技术相比具有以下优势：明显提高产量，适于批量生产；降低经济成本和时间成本；蛋白纯度高，可减少试剂残留，绿色环保。附图说明：附图1为本专利技术实施例制备所得的N16蛋白序列图。具体实施方式：下面将用具体的实施例进一步说明本专利技术的技术。实施例1：从马氏珠母贝Pinctadafucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA。根据NCBI数据库N16的基因序列，设计引物N16F(5’-GGAATTCGCTGTCCATTATAAGTGC-3’)和第二个引物N16R(5’-CGTTAATTGTCAAACCGTTC-3’)，其中下划线部位碱基分别为NdeI和BamHI限制性内切酶位点。利用PCR法扩增N16基因，反应程序设为95℃1分钟，50℃20秒，72℃1分钟，共25个循环，最后72℃10分钟。扩增所得N16基因连接到表达载体pRhisMBP上，并导入BL21(DE3)plysScompetentEscherichiacoli，用于表达N16蛋白。当BL21(DE3)plysScompetentEscherichiacoli生长到对数期，加入0.4mMIPTG，37℃诱导N16的表达。16h后，收集菌体。N16的纯化，将表达菌体分散在20mMTris-HCl(pH7.0)中，超声破碎，离心，弃上清。不溶物以washingbuffer(2Murea,20mMTris,0.1％Tween20,pH7.0)超声溶解。离心，收集不溶物，再以solubilizingbuffer(8Murea,20mMTris,40mMbeta-mercaptoethanol,pH7.0)室温溶解过夜。离心，取上清，超滤浓缩，0.45μm滤膜过滤。以Superdex75柱子进行凝胶排阻层析，分离纯化N16，其中，流动相为8Murea,20mMTris,40...

【技术保护点】
一种珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA；根据NCBI数据库N16的基因序列，设计以下引物：N16F(5’‑GGAATTCGCTGTCCATTATAAGTGC‑3’)，和N16R(5’‑CGTTAATTGTCAAACCGTTC‑3’)，其中下划线部位碱基分别为NdeI和BamHI限制性内切酶位点；(2)利用PCR法扩增N16基因，反应程序设为90～100℃ 0.5～2分钟，45～60℃ 20～60秒，72℃ 0.5～2分钟，共20～40个循环，最后65～75℃ 5～15分钟；扩增所得N16基因连接到表达载体pRhisMBP上，并导入BL21(DE3)plysS重组大肠杆菌，用于表达N16蛋白；当BL21(DE3)plysS重组大肠杆菌生长到对数期，加入0.1～1mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，25～37℃诱导N16的表达6～16h，收集菌体；(3)将收集的表达菌体在pH＝6.5～8.5的环境下分散在0.01～1M Tris‑HCl中，超声破碎，离心，弃上清，不溶物以洗涤缓冲液超声溶解，离心，收集不溶物，再以溶解缓冲液室温溶解过夜，离心，取上清，超滤浓缩；以凝胶排阻层析柱对N16进行，收集分液，15％SDS‑PAGE检测N16；合并含N16的分液，装入透析袋，以50～150倍体积的0.1～20mM磷酸缓冲液进行去盐复性，得目标产品。...

【技术特征摘要】
1.一种珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)从马氏珠母贝Pinctadafucata中提取总mRNA，经逆转录，
产生单链cDNA；根据NCBI数据库N16的基因序列，设计以下引物：
N16F(5’-GGAATTCGCTGTCCATTATAAGTGC-3’)，和N16R
(5’-CGTTAATTGTCAAACCGTTC-3’)，其中下划线部位碱基分别
为NdeI和BamHI限制性内切酶位点；
(2)利用PCR法扩增N16基因，反应程序设为90～100℃0.5～
2分钟，45～60℃20～60秒，72℃0.5～2分钟，共20～40个循环，
最后65～75℃5～15分钟；扩增所得N16基因连接到表达载体
pRhisMBP上，并导入BL21(DE3)plysS重组大肠杆菌，用于表达
N16蛋白；当BL21(DE3)plysS重组大肠杆菌生长到对数期，加入
0.1～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～37℃诱导N16的
表达6～16h，收集菌体；
(3)将收集的表达菌体在pH＝6.5～8.5的环境下分散在0.01～
1MTris-HCl中，超声破碎，离心，弃上清，不溶物以洗涤缓冲液
超声溶解，离心，收集不溶物，再以溶解缓冲液室温溶解过夜，离心，
取上清，超滤浓缩；以凝胶排阻层析柱对N16进行，收集分液，15％
SDS-PAGE检测N16；合并含N16的分液，装入透析袋，以50～150倍
体积的0.1～20...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏薇薇，徐祯彦，马洁仪，彭维，李沛波，王永刚，
申请(专利权)人：中山大学，东莞中山大学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44